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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8NGG38| Type: | Dissertação de Mestrado |
| Title: | RasGEF1b: localização celular de seus domínios e papel regulador negativo sobre a ativação de NF-kappaB |
| Authors: | Thalita Marcolan Valverde |
| First Advisor: | Aristobolo Mendes da Silva |
| First Referee: | Luciana de Oliveira Andrade |
| Second Referee: | Gustavo Batista de Menezes |
| Abstract: | O fator de troca de nucleotídeo guanina, RasGEF1b, representa uma proteína fortemente induzida em resposta à estimulação com agonistas inflamatórios dos receptores do tipo Toll (TLR, do inglês Toll like receptors). Uma vez que RasGEF1b é uma proteína de localização endossômica e de expressão induzida na resposta imune inata mediada por TLRs, tivemos como objetivo inicial avaliar o efeito do ganho-de-função de RasGEF1b e seus domínios sobre a ativação de NF-kB induzida na resposta inflamatória, assim como analisar adistribuição celular. Para isso, ensaios de gene repórter foram realizados e demonstraram que RasGEF1b exibe um efeito regulatório negativo sobre a ativação de NF-kB mediada pelos componentes da via de TLRs, Mal-Tirap e TAK1/TAB1. Para avaliar o efeito dos domínios amino e carboxi-terminal de RasGEF1b sobre a ativação de NF-kB, foi necessário clonar separadamente as regiões codificadoras referentes aos domínios no vetor de expressão eucariótica pFLAG-CMV4. Ensaios de transfecção transiente foram realizados inicialmente em células epiteliais humanas HEK293A. Análises por ensaios de gene repórter demonstraram que os domínios amino e carboxi-terminal de RasGEF1b exibem um efeito regulatório negativo sobre a ativação de NF-kB mediada pelos componentes da via de sinalização de TLRs, Mal-Tirap e TAK1/TAB1, mas não por p65. No entanto, não foram visualizadas diferenças significativas entre os domínios sobre a ativação de NF-kB. Ainda, observamos que RAP2A e/ou a co-transfecção com RasGEF1b exibiram efeito regulatório negativo sobre a ativação de NF-kB, mediada por TNF-. Para analisar a distribuição celular dos domínios de RasGEF1b, as regiões codificadoras referentes aos domínios amino ecarboxi-terminal desse GEF foram clonadas no vetor de expressão eucariótica pEGFP-N1. Os resultados por microscopia de fluorescência demonstraram que RasGEF1b-amino-terminal possui localização citoplasmática, com marcação um pouco mais intensa em regiõesassociadas a membranas celulares. Entretanto, RasGEF1b-carboxi- terminal mostrou distribuição organizada preferencial por núcleo celular, mas com expressão também citoplasmática. Nossos resultados indicam que RasGEF1b exibe um importante efeito sobre a regulação de NF-kB e potencial função na resposta inflamatória |
| Abstract: | The guanine nucleotide exchange factor RasGEF1b is a protein encoded by a gene whose expression is strongly induced in response to stimuli with Toll-like receptor (TLR) agonists. RasGEF1b is found localized at the early endosomes associated with Ras, but no cellular function has yet been defined. Our goal was to assess the effect of the gain-offunction of this protein and its domains in the activation of NF-kB transcription factor induced in the inflammatory response, as well as to analyze its cellular distribution. To this end, luciferase reporter gene assays were carried out to investigate whether RasGEF1b displays any regulatory effect on the activation of NF-kB mediated by the signaling pathway of TLRs, Mal-Tirap, and TAK1/TAB1. In order to assess the effect of the amino and carboxiterminal domains of RasGEF1b in NF-kB activation, we cloned the coding regions corresponding to these domains in the eukaryotic expression vector pFLAG-CMV4. Transient transfection assays were initially carried out in HEK293A epithelial cell line. Reporter gene assays demonstrated that the amino and carboxi-terminal domains of RasGEF1b exhibit a negative regulatory effect in the activation of NF-kB mediated by the signaling pathway components of TLRs, Mal-Tirap, and TAK1/TAB1, but not by p65/Rel-A. However, no significant difference in the activation of NF-kB was observed between these two domains. Moreover, we observed that the transfection of either RAP2A or RasGEF1b, or both exhibit a negative regulatory effect on the activation of NF-kB mediated by TNF. To analyze the cellular distribution of the domains of RasGEF1b, the coding regions corresponding to the amino and carboxi-terminal domains of this GEF were cloned in the eukaryotic expression vector pEGFP-N1. The results of the fluorescence microscopy demonstrated that RasGEF1bamino- terminal is located in the cytoplasm, with a slightly increased fluorescence in regions associated with cell membranes. On the other hand, RasGEF1b-carboxi-terminal showed a distribution organized preferentially in the cell nucleus. Our results suggest that RasGEF1b has an important effect in the regulation of NF-kB and a potential role in the inflammatory response |
| Subject: | Receptores Toll-Like Biologia celular Proteínas G Fatores de troca do nucleotídeo guanina |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8NGG38 |
| Issue Date: | 29-Jul-2011 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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