Diferenças intra-específicas no sistema de reparo de erros de pareamento e na resposta ao estresse oxidativo em Trypanosoma Cruzi: o papale da proteína TcMSH2

Abstract

Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas, possui uma população altamente heterogênea, composta de um pool de cepas e clones com características distintas, tais como morfologia, taxas de crescimento, virulência e sensibilidade a drogas. Esta diversidade pode ser um reflexo da variabilidade genética intra-específica que, como em outros organismos, é originada principalmente por mutações e rearranjos gênicos. Entretanto, os mecanismos que levam a esta diversidade em T. cruzi não estão completamente esclarecidos. Análisesfilogenéticas serviram de base para uma proposição de classificação do táxon T. cruzi em três linhagens principais, denominadas T. cruzi I, II e III. Como estudos relacionados a funções envolvendo metabolismo de DNA principalmente reparo e recombinação ainda são escassos, o presente trabalho teve como objetivo estudar o papel de uma destas vias de reparo de DNA, o sistema de reparo de erros de pareamento ou MMR, na geração de variabilidade genética em T. cruzi. Polimorfismos no gene Tcmsh2 resultam na expressão de três isoformas da proteína TcMSH2 (um componente chave do MMR) características de cada linhagem. A comparação das taxas de crescimento de cepas pertencentes aos haplogrupos A (T. cruzi I) e C (T. cruzi II) frente à exposição a agentes genotóxicos, bem como a determinação dos níveis de dano no DNA induzido por estresse oxidativo, forneceram evidências de que cepas pertencentes à linhagem T. cruzi I apresentam uma capacidade de reparo mais eficiente. O cultivo de parasitos na presença de cádmio, um inibidor da via de MMR, juntamente com os resultados de ensaios in vitro com proteínas recombinantes indicam que diferenças observadas entre as cepas podem ser, em parte, devido às diferenças na atividade de TcMSH2. A fim de investigar melhor o papel do MMR e, mais precisamente, da proteína TcMSH2 na geração de variabilidade genética em T. cruzi, foram geradas linhagens heminocautes para o gene Tcmsh2. Os resultados obtidos sugerem que, além do seu papel no MMR, a proteína TcMSH2 exerça uma função MMRindependente importante na resposta ao estresse oxidativo, o que impossibilitaria a deleção de ambos os alelos. Esta função parece ser conservada em um tripanossomatídeo relacionado, T. brucei. Como estratégia alternativa, vetores para transfecção de T. cruzi foram construídos de maneira a gerar parasitos 11 superexpressando o gene Tcmsh2. Entretanto, devido possivelmente a mecanismos que controlam a expressão do gene Tcmsh2, não foi possível obter linhagens transfectadas expressando altos níveis dessa proteína. Com o objetivo adicional de estudar quais são os sinais importantes para a expressão de um gene exógeno em T. cruzi, de forma a aperfeiçoar vetores já utilizados, foram realizadas análises in silico onde procuramos investigar melhor os requerimentos necessários para o processamento correto, através de trans-splicing e poliadenilação, dos mRNAs no parasito. Essas análises mostraram que a distância mediana entre os motivos de polipirimidinas (sinais já conhecidos como importantes para o processamento do mRNA) e os sítios de trans-splicing e os de poliadenilação é de 18 e 40 nt, respectivamente. Os motivos de polipirimidinas apresentaram tamanhos medianos de 11 nt (acima do sítio de trans-splicing) e 12 nt (abaixo do sítio de poliadenilação). Os tamanhos médios de 5UTR (35 nt) e 3UTR (137 nt) obtidos corroboram resultados anteriores, que indicam que o genoma de T. cruzi é mais compacto quando comparado com outros tripanossomatídeos, tais como T. brucei e Leishmania major