Please use this identifier to cite or link to this item:
http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8Z7QKV| Type: | Tese de Doutorado |
| Title: | Avaliação da diferenciação osteogênica de células-tronco do tecido adiposo humano cultivadas em espuma de vidro bioativo e biorreator de perfusão para engenharia de tecido ósseo |
| Authors: | Alexandra Rodrigues Pereira da Silva |
| First Advisor: | Marivalda de Magalhaes Pereira |
| First Co-advisor: | Alfredo Miranda de Goes |
| Abstract: | A Engenharia de Tecidos é uma ciência multidisciplinar cujo objetivo é combinar células a uma matriz estrutural para formar um construto capaz de promover a regeneração do tecido lesado. A espuma de vidro bioativo (BV) produzida pelo processo sol-gel é um material osteoindutor que fornece uma rede de macroporos interconectados necessária à colonização celular. O emprego das células-tronco do tecido adiposo humano (hASC) apresenta vantagens como facilidade de coleta, grande número de células obtidas e rápida expansão in vitro, capazes de se diferenciar em osteoblastos. O uso de biorreatores (BR) para o cultivo celular tridimensional em matriz permite uma maior eficiência de nutrição das células e aplicação de forças mecânicas, importantes moduladoras da fisiologia celular óssea. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho é avaliar a diferenciação osteogênica de hASC semeadas em espuma de vidro bioativo através do cultivo tridimensional em biorreator de perfusão para a produção de um construto funcional para a engenharia de tecido óssea. Inicialmente foi realizada a síntese e caracterização químico-estrutural da espuma de BV, que apresentou uma rede de poros de 100-500m interconectados e porosidade de 88%. A montagem do BR, assim como a verificação da degradação e bioatividade das espumas de BV de maneira estática e dinâmica, mostraram que o cultivo dinâmico com taxa de fluxo de 0,1mL/min foi capaz de manter o pH da solução de SBF e de permear a amostra, através da deposição da camada de hidroxiapatita carbonatada no interior dos poros do interior das amostras. Foram realizadas a obtenção e caracterização das hASC e o desenvolvimento de protocolo para o cultivo das hASC em meio Leibovitz independente de CO2 (LEI) para uso no BR de perfusão, que evidenciou uma melhor adaptação de maneira gradual. Também foi realizada uma comparação entre hASC cultivadas em meio padrão DMEM e no meio LEI, as quais apresentaram semelhança morfológica e fenotípica e foram capazes de se diferenciar no fenótipo osteogênico quando em meio LEI suplementado com os fatores osteogênicos (LEI O). Desta forma, os próximos ensaios foram realizados em meio LEI e LEI O. O cultivo estático das hASC semeadas na matriz de BV e em meio LEI e LEI O por 7, 14 e 21 dias mostrou uma ótima adaptação das células à matriz e aos meios testados, um pico de atividade da fosfatase alcalina (FA) aos 14 dias de cultivo em meio LEI, o que evidenciou a ação osteoindutora do material sobre as hASC, teste que foi confirmado pela imunofluorescência. Finalmente, foi realizado o cultivo das hASC em matriz de BV no biorreator de perfusão, os quais demonstraram aumento significativo da viablilidade e proliferação celular aos 7 dias de cultivo, pico de atividade da FA aos 14 dias de cultivo, com uma produção maior no grupo cultivado em meio LEI. Além disso, os ensaios de imunofluorescência evidenciaram a expressão de osteopontina (OP), osteocalcina (OC) e colágeno tipo I a partir de 7 dias e com maior evidência da fluorescência aos 21 dias de cultivo para o meio LEI O e a evolução das células de um formato fusiforme para o formato cuboidal. A imunofluorescência do grupo cultivado em meio LEI aos 21 dias também evidenciou a expressão das três proteínas, mas de maneira menos intensa e com menor alteração na morfologia celular. O ensaio de PCR confirmou a expressão dos genes da OP, OC e FA, expressos pelas hASC em todos os períodos de cultivo no biorreator de perfusão com meio LEI O. Portanto, pode-se concluir que as hASC cultivadas em BV e LEI O de maneira dinâmica apresentaram alteração fenotípica para células osteoblásticas, evidenciando se tratar de uma estratégia de cultivo celular promissora para obtenção de um construto funcional para a engenharia de tecido ósseo. |
| Abstract: | Tissue Engineering is a multidisciplinary science whose goal is to combine a structural matrix and cells to form a construct able to promote regeneration of injured tissue. Bioactive glass foam (BG) produced by sol-gel is an osteoinductive material that provides a network of interconnected macropores necessary for cell colonization. The use of human adipose stem cells (hASC) present advantages such as easy collecting, large numbers of cells and rapid expansion in vitro, capable of differentiating into osteoblasts. The use of bioreactors (BR) in three-dimensional cell culture enables greater efficiency for cell nutrition and application of mechanical forces, important modulators of bone cell physiology. In this context, the objective of this study is to evaluate the osteogenic differentiation of hASC seeded on bioactive glass foam and cultured in three-dimensional perfusion bioreactor for the production of a functional construct for bone tissue engineering. The synthesis and characterization of BG was initially performed, resulting in an interconnected network with pore size range 100-500m and 88% porosity. Evaluation of static and dynamic degradation and bioactivity of BG foam showed that 0.1 ml/min flow rate was able to maintain the pH of the SBF solution and permeate the sample, and led to deposition of a carbonated hydroxyapatite layer on the sample surface and inner pores. The extraction and characterization of hASC were performed and a new protocol for hASC cultivation in Leibovitz CO2 independent medium (LEI) was developed for use in the perfusion BR. A comparison between hASC grown in standard DMEM and LEI was also performed, showing similar morphological and phenotypic caracteristics and ability to differentiate into osteogenic phenotype when cultured in LEI supplemented with osteogenic factors (LEI O). The static cultivation of hASC seeded on the BG foam in LEI for 7, 14 and 21 days showed a great adaptation of cells to the matrix at 7 days, a peak of alkaline phosphatase activity (ALP) at 14 days in LEI, evidencing the BG osteoinductive action on hASC, which was confirmed by immunofluorescence. Finally, the hASC cultivation on BG in the BR demonstrated a significant increase in cell proliferation and viability at 7 days of culture, ALP activity peak at 14 days, with increased production in LEI group. In addition, immunofluorescence assay revealed expression of osteopontin (OP), osteocalcin (OC) and collagen type I from 7 to 21 days culture, being more evident and strong at 21 days culture in LEI O . Moreover, the cells changed from a spindle form to a cuboidal shape. Immunofluorescence of the group cultivated in LEI at 21 days also showed the expression of these proteins, but with a less intense signal and lower change in cell morphology. The PCR assay confirmed the expression of OP, OC and FA genes expressed by hASC at all cultivation times in LEI O in the perfusion bioreactor. Therefore it can be concluded that hASC seeded in BG and cultivated in BR presented phenotypic change to osteoblastic cells, suggesting this is a promising strategy for cell culture to obtain a functional construct for bone tissue engineering. |
| Subject: | Engenharia metalúrgica |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8Z7QKV |
| Issue Date: | 2-Mar-2012 |
| Appears in Collections: | Teses de Doutorado |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| tese_ufmg_alexandra_2012.pdf | 4.15 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.