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Type: Tese de Doutorado
Title: Eventos epigenéticos no ameloblastoma: um enfoque na metilação e transcrição de metaloproteinases da matriz e perda de heterozigosidade do gene PTCH
Authors: Lucyana Conceic?o Farias
First Advisor: Ricardo Santiago Gomez
First Co-advisor: Carolina Cavalieri Gomes
First Referee: Carolina Cavalieri Gomes
Second Referee: Paula Rocha Moreira
Third Referee: Vanessa de Fátima Bernardes
metadata.dc.contributor.referee4: Martinho Campolina Rebello Horta
metadata.dc.contributor.referee5: Alfredo Mauricio Batista De Paula
Abstract: O ameloblastoma é um tumor odontogênico benigno que apresenta comportamento agressivo e elevadas taxas de recorrência. Estudos foram realizados visando elucidar os mecanismos moleculares e alterações genéticas envolvidas na patogênese do tumor. Expressão aumentada de metaloproteinases da matriz (MMPs) foi identificada no ameloblastoma. Alterações na via de sinalização Hedgehog, incluindo mutações no gene PTCH, também foram associadas à patogênese de alguns tumores odontogênicos. O presente estudo teve como foco duas abordagens de pesquisa: a metilação de MMPs e a perda de heterozigosidade (LOH) no locus cromossômico do gene PTCH no ameloblastoma. Na primeira proposta de pesquisa, foram investigadas a metilação dos genes MMP-2 e MMP-9, juntamente com os níveis de transcrição de tais genes e a expressão da proteína no tumor odontogênico em questão. Para verificar o padrão de metilação, foi realizada PCR-MSP e análise de metilação baseada em sítios de restrição em 12 amostras de ameloblastoma, 12 folículos pericoronários e 12 fragmentos de gengiva saudável, incluídos como grupo controle. Além disso, foram investigados os níveis de transcrição dos genes através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), e pela técnica de zimografia, analisou-se a expressão protéica das MMPs. Ameloblastomas e folículos pericoronários apresentaram maior frequência de MMP-2 e MMP-9 não-metilados, ao passo que as amostras de gengiva apresentaram uma acentuada prevalência das MMPs metiladas. Os folículos revelaram uma expressão aumentada significativa de mRNA MMP-2, em relação ao ameloblastoma e gengiva. No entanto, maiores níveis de expressão de MMP-9 foram identificados no ameloblastoma, comparado aos demais grupos. Todas as amostras do tumor apresentaram expressão das proteínas MMP-2 e MMP-9. Assim, a análise dos resultados sugere que a expressão de MMP-9 no ameloblastoma seja, possivelmente, associada ao perfil não-metilado do gene. Para a outra proposta de estudo, foi investigada a LOH no locus cromossômico do gene PTCH em 12 amostras de ameloblastomas. Para tal análise, foram avaliados três marcadores microssatélite (D9S252, D9S127 e D9S287) e três regiões de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) (rs112794371, rs111446700 e rs357564), sendo todos os SNPs localizados em posição intragênica do PTCH. Além disso, os níveis de transcrição de GLI-1 e GLI-2 foram avaliados por qRT-PCR em 8 amostras de ameloblastomas e, concomitantemente, a expressão da proteína PTCH foi investigada por imuno-histoquímica. LOH na região 9q21.33-9q.31 foi verificada em 4/10 (40,0%) dos casos informativos do tumor. Todas as 8 amostras analisadas expressaram o transcrito GLI-1 e, em 7 casos, o GLI-2. A LOH no locus do gene PTCH não mostrou associação com os níveis de transcrição de GLI-1, GLI-2 ou mesmo com a expressão da proteína PTCH. Considerando todos os resultados das abordagens estudadas, os achados pontuam para uma expressão aumentada de MMP-9 no ameloblastoma, possivelmente modulada pelo perfil de metilação. Além disso, a identificação de LOH na região do PTCH sugere que tal evento pode ser relevante na patogênese do tumor, tendo como alvo outros genes supressores de tumor localizados no mesmo locus do PTCH. Estes resultados podem ser novos caminhos que necessitam ser mais explorados para o entendimento da patogênese do ameloblastoma.
Abstract: Ameloblastoma is a benign odontogenic neoplasm with an aggressive behavior and high recurrence rates. Some studies have been performed to elucidated molecular mechanisms and genetic alterations evolving tumor pathogenesis. Increased expression of matrix metalloproteinases (MMPs) is reported in ameloblastomas. Alterations in the Hedgehog signalling pathway, including PTCH gene mutations, also have been associated with the pathogenesis of some odontogenic tumours. In the present study, we focalizes two purposes of search related to methylation of matrix metalloproteinasis and heterozygosity loss (LOH) in the chromosome locus of PTCH gene. In the first, we hypothesized that epigenetic alterations may regulate MMP expression in ameloblastomas. Therefore, we investigated the MMP-2 and MMP-9 genes methylation status together with mRNA transcription and protein expression in ameloblastoma. Methylation-specific polymerase chain reaction (MSP-PCR) and methylation analysis by restriction enzyme was performed to evaluate methylation profile of MMP-2 and MMP-9 genes in 12 ameloblastoma samples, 12 dental follicles and 12 healthy gingiva fragments, included as controls. Furthermore, we investigated the transcription levels of the genes by quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR). Zymography was performed to verify protein expression. Ameloblastoma and dental follicle showed a high frequency of unmethylated MMP-2 and MMP-9, whereas healthy gingival samples presented a sharp prevalence of methylated MMPs. Dental follicles showed a significantly higher MMP-2 mRNA expression than ameloblastomas and healthy gingiva. However, higher expression levels of MMP-9 were found in ameloblastomas than in dental follicles and healthy gingiva. All ameloblastomas showed positive expression of MMP-2 and MMP-9 proteins. To other purpose of study, we assess LOH at the PTCH locus in ameloblastoma. Twelve ameloblastomas were included and LOH was assessed by using 3 microsatellite markers D9S252, D9S127, and D9S287, and 3 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) rs112794371, rs111446700, rs357564 all located at the PTCH gene locus. Furthermore, we investigated GLI1 and GLI2 transcription levels by quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) in 8 ameloblastomas and concomitantly, PTCH protein levels by immunohistochemical analysis. LOH at 9q21.33-9q.31 was detected in 4/10 (40.0%) informative cases of ameloblastoma. All 8 analyzed samples expressed GLI1 mRNA and seven cases GLI2 mRNA. Interestingly, LOH at the PTCH locus was not correlated with GLI1 or GLI2 transcription levels, nor was there any correlation with PTCH protein expression. Considering all results, our findings point to an increased expression of MMP-9 in ameloblastoma, possibly modulated by methylation of the gene. Furthermore, we suggested that LOH in the PTCH region may be relevant to the pathogenesis of ameloblastoma, but may target a different gene than PTCH. All together, these can be new insights that need to be more explored to understand pathogenesis of ameloblastoma.
Subject: Medicina molecular
Genetica molecular
Ameloblastoma/patologia
Metaloproteinases da matriz
Perda de heterozigosidade
Proliferação de células
Epigênese genética 
Patologia
Tumores odontogênicos
Metilação
Expressão gênica
language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials: UFMG
Rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9AUHAG
Issue Date: 25-May-2012
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