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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9C6GRZ| Type: | Tese de Doutorado |
| Title: | Caracterização das propriedades funcionais e probióticas de bactérias láticas isoladas de cães para uso em vacinas orais contra leptospirose como adjuvante imune ou carreador antigênico |
| Authors: | Lenice Roteia Cardoso Jung |
| First Advisor: | Alvaro Cantini Nunes |
| First Co-advisor: | Maria Rosa Quaresma Bomfim |
| Abstract: | A leptospirose canina tem aumentado significativamente nos últimos anos. No Brasil alguns estudos têm demonstrado o caráter endêmico dessa zoonose em cães e que estes animais podem exibir o status de portadores renais crônicos da Leptospira. A exposição e o convívio do homem com os cães poderão torná-lo vulnerável à infecção por Leptospira. Na intenção de desenvolver uma vacia oral contra a leptospirose canina busca-se avaliar a possibilidade de usar lactobacilos autóctones como veículos ou adjuvantes vacinais. Para isso, setenta e nove linhagens bacterianas foram isoladas das fezes de cães lactentes, em meio seletivo para bactérias láticas e analisadas. Destas, 41 eram Gram positivo e catalase negativo, sugestivo de Bactérias Láticas. As linhagens foram identificadas molecularmente por Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) dos espaçadores entre os genes 16S e 23S rRNA. Ao final, 37 isolados pertencentes ao gênero Lactobacillus distribuíram-se em 6 espécies Lactobacillus reuteri (16/37; 43,3%), Lactobacillus animalis (7/37; 18,9%), Lactobacillus acidophilus (3/37; 8,1%), Lactobacillus sanfranciscensis (2/37; 5,4%), Lactobacillus murinus (2/37; 5,4%) e Lactobacillus paraplantarum (1/37; 2,7%). Essas linhagens de Lactobacillus foram avaliadas quanto a propriedades funcionais desejáveis em probióticos. Na avaliação geral, dos Lactobacillus, isolados de cães, com características probióticas e possíveis candidatos a veículos ou adjuvantes vacinais orais, destacaram-se seis isolados de L. reuteri e um isolado pertencente à espécie L. paraplantarum. Os isolados da espécie L. reuteri foram diferenciados em três linhagens diferentes, de acordo com as sequências poli-trinucleotídicas intercaladas (GTG5). Duas espécies de lactobacilos L. reuteri (isolado 2) e L. paraplantarum (isolado 15) tiveram testadas a sua capacidade imunomodulatória a partir da suplementação por via oral de Golden Syrian Hamsters, identificando-se as citocinas expressas, por RT qPCR. A espécie L. reuteri demonstrou-se boa moduladora ao induzir citocinas pró-inflamatórias e ativar também citocinas regulatórias da resposta imunológica nos hamsters. a espécie L. paraplantarum apresentou baixa atividade imune. Os antígenos LipL32 e Loa22 de três sorovares de Leptospira, foram amplificados, sequenciados e posteriormente alinhados, entre si e com sequências homólogas de outros sorovares disponíveis, confirmando o alto grau de conservação evolutiva desses genes. LipL32 foi sintetizada e sua fração solúvel purificada, obtendo-se 7,96 mg da proteína por litro de cultura induzida. Foram produzidos antisoros anti-leptospira, com a inoculação de uma vacina comercial, produzida com 5 sorovares de L. interrogans, em camundongos BALB/c. A massa molecular da proteína LipL32 foi determinada por Western blot, pela ligação do soro antileptospira, na posição correpondente a 32 kDa. Foram produzidos antisoros policlonais, anti-LipL32, em camundongos, para uso na confirmação dessa proteína, em novas purificações. |
| Abstract: | Leptospirosis is an important reemerging infectious disease that affects populations worldwide. Caused by pathogenic spirochaetes of the genus Leptospira, the disease presents higher incidence in tropical and subtropical regions. Aimming new live vehicles or immune adjuvants for a new leptospirosis vaccine, Lactic Acid Bacteria were isolated and identified in the faeces of Chinese Crested and Yorkshire terrier pups and their probiotic features were investigated in vitro. Thirty-seven isolates were identified as Lactobacillus or Enterococcus. Out of these isolates, 31 were lactic acid bacteria (LAB) and belonged to the species Lactobacillus reuteri (16/37; 43.3%), Lactobacillus animalis (7/37; 18.9%), Lactobacillus acidophilus (3/37; 8.1%), Lactobacillus sanfranciscensis (2/37; 5.4%), Lactobacillus murinus (2/37; 5.4%), and Lactobacillus paraplantarum (1/37; 2.7%), while six other LAB isolates were Enterococcus spp. (6/37; 16.2%). Based on these results, two Lactobacillus strains L. paraplantarum (15) and L. reuteri (2) showed promising probiotic-related features and merit investigation as probiotics for dogs. Golden Syrian Hamsters fed with both strains had immunomodulatory properties assessed by RT-qPCR for selected cytokines and they stimulated proinflammatory (INF-, IL-12, TNF- ) and regulatory cytokines (IL-10, TGF-). The genes of LipL32 and Loa22 antigens of three Leptospira serovars were amplified by PCR, sequenced and then aligned with each other, confirming the high degree of evolutionary conservation of these genes. Recombinant LipL32 (rLipL32) was expressed in an E. coli heterologous system and purified as soluble fraction, yielding 7.96 mg of protein per liter of IPTG-induced culture. Antisera against Leptospira, were produced in BALB/c mice by inoculation of a commercial vaccine produced with five serovars of L. interrogans. The molecular mass of rLipL32 was determined by Western blot to be 32 kDa. Polyclonal antisera anti-rLipL32 was also produced in mice. Recombinat Loa antigen was not produced at this time. |
| Subject: | Resposta imune Antígenos recombinantes Leptospirose Vacina Genética Citocinas Lactobacilo |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9C6GRZ |
| Issue Date: | 30-Aug-2013 |
| Appears in Collections: | Teses de Doutorado |
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