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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9NBGC3| Type: | Dissertação de Mestrado |
| Title: | Análise in situ dos efeitos da temperatura no crescimento de cristais de proteína |
| Authors: | Thiago Martins Francisco |
| First Advisor: | Carlos Basilio Pinheiro |
| First Co-advisor: | Pedro Licinio de Miranda Barbosa |
| First Referee: | Roberto Luiz Moreira |
| Second Referee: | Ronaldo Alves Pinto Nagem |
| Abstract: | Estudos sobre a cristalização em extratos biológicos realizados em meados do século XIX contribuíram para a descoberta das proteínas. Na segunda metade do século XX foram desenvolvidas técnicas da Biologia Molecular que possibilitam a produção em larga escala de proteínas e a difração de raios X tornou-se a principal ferramenta de investigação de estrutura destas moléculas. Desde os primeiros experimentos até os dias atuais, o processo de cristalização tem sido o grande gargalo para a realização de estudos estruturais de proteínas. Os protocolos de cristalização utilizados atualmente consistem em misturar um conjunto de soluções de precipitantes, aditivos e soluções tampão com a solução de proteína para promover a cristalização, desprezando diversos parâmetros físicos. Amostras cristalinas são obtidas por tentativa e erro e com grande taxa de irreprodutibilidade. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos da temperatura no processo de cristalização de proteínas. Foram realizados ensaios de cristalização com a proteína lisozima em diferentes temperaturas nos quais foram observados uma dramática mudança de regime de crescimento, com impacto sobre o número e tamanho médio de cristais obtidos acima e abaixo de 12oC. Para avaliar a influência da temperatura na dinâmica de formação dos cristais de lisozima, foram realizados ensaios de cristalização com monitoramento in situ pela técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS). Esta técnica permitiu determinar o tamanho médio dos agregados de proteínas em solução durante a cristalização. Os resultados obtidos indicam que a temperatura não altera a evolução temporal das raios dos agregados e que a quantidade deles em solução é maior para temperaturas mais baixas. Cristais obtidos em diferentes temperaturas foram analisados utilizando difração de raios X e as estruturas obtidas não apresentaram nenhuma mudança relevante. Ainda há lacunas nas teorias que descrevem a dinâmica do processo de cristalização de proteínas que justificam estudos posteriores sobre este fenômeno visando, sobretudo, a elaboração de protocolos de cristalização mais assertivos. |
| Abstract: | Studies on crystallization in biological extracts made in the mid-nineteenth century contributed to the discovery of proteins. In the second half of the twentieth century Molecular Biology techniques enabled large-scale production of proteins and X-ray diffraction became the main tool for the investigation of protein structure. From the earliest experiments to the present day, the crystallization process has been the major bottleneck to structural studies of proteins. The current crystallization protocols consist of mixing the precipitating agents, buffers, and additives to the protein solution to promote crystallization discarding various physical parameters. Crystalline samples are obtained by trial and error and with a great rate of non-reproducibility. The aim of this work was to study the effects of the temperature on the protein crystallization process. Crystallization trials with the protein lysozyme at different temperatures showed change of the growth regime, with a remarkable change in the number and in the average size of crystals obtained above and below 12oC. In order to study the influence of temperature on the dynamics of the formation of crystals of lysozyme, crystallization trials with the in situ monitoring by Dynamic Light Scattering technique (DLS) were performed. This technique allowed the determination of the average size of the protein aggregates in solution during crystallization. The results indicated that the temporal evolution of the radii of the aggregates is not affected by temperature. However the amount of aggregates in solution is higher for lower temperatures. Crystals obtained at different temperatures were finally analyzed by X-ray diffraction techniques and the structures obtained did not show any significant change. There are still gaps in the theories that describe the dynamics of the protein crystallization process that justify further studies of this phenomenon, targeting above all, more assertive crystallization protocols. |
| Subject: | Física |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9NBGC3 |
| Issue Date: | 30-Jan-2014 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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