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http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9UVNGZ| Type: | Dissertação de Mestrado |
| Title: | Caracterização in silico, clonagem e expressão heteróloga em Escherichia coli de cinco proteínas de Corynebacterium pseudotuberculosis possivelmente implicadas na virulência deste microrganismo |
| Authors: | Karina Talita de Oliveira Santana |
| First Advisor: | Vasco Ariston de Carvalho Azevedo |
| Abstract: | Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente causador da Linfadenite caseosa (LC), doença que acomete pequenos ruminantes e acarreta diminuição de produtividade e prejuízos no agronegócio. Diferentes abordagens são estudadas visando o controle desta doença através da identificação de novas drogas ou desenvolvimento de testes diagnóstico e vacina. No entanto, ainda não foi alcançada eficácia satisfatória para o controle da LC. O sequenciamento de genomas de Corynebacterium pseudotuberculosis tem possibilitado a identificação de novos fatores de virulência deste microrganismo o que contribui para o melhor entendimento de sua biologia e das relações patógeno-hospedeiro. Neste trabalho, foram selecionadas como alvo de estudo, com base em análises in silico e busca na literatura, as proteínas PLD, PknG, SpaC, SodC e NanH. A PLD representa o principal fator de virulência de C. pseudotuberculosis e as demais são indicadas como potenciais fatores de virulência. Foram realizadas as caracterizações in silico destas proteínas a partir de predições de parâmetros físico-químicos, peptídeo sinal, domínios conservados, avaliação da sua conservação em eucariotos e epítopos. Além disso, as proteínas foram expressas utilizando sistema de expressão heteróga em Escherichia coli e foram testadas cinco diferentes linhagens de expressão. A partir das linhagens que apresentaram o melhor nível de expressão de cada uma das proteínas, avaliou-se a cinética de expressão e a solubilidade da fração protéica. A proteína PknG foi purificada após otimização do protocolo de expressão para obtenção da proteína na fração solúvel e a purificação foi confirmada por Western blot. A partir da purificação das demais proteínas, esperamos avaliá-las quanto à sua antigenicidade e proteção contra infecção. Uma vez que fatores de virulência são importantes candidatos a alvos de drogas, testes diagnóstico ou, ainda, alvos vacinais, a obtenção destas proteínas é importante por viabilizar diversos estudos que podem contribuir para o desenvolvimento de uma estratégia de controle da LC. |
| Abstract: | Corynebaterium pseudotuberculosis is the causative agent of Caseous lymphadenitis (CL), a disease that affects small ruminants and results in decreased productivity and loss in the agribusiness. Different approaches aim the control of this disease by identifying new drugs and developing new vaccines and diagnostic tests. However, there is not yet an satisfactory and efficient method for the control of LC; nevertheless, the sequencing of the genomes of Corynebacterium pseudotuberculosis has enabled the identification of new virulence factors of this microorganism that may contribute to a better understanding of its biology and host-pathogen relationships. In this work, proteins PLD, PknG, SpaC, SodC and NanH were selected as targets of the study based on in silico analysis and literature data mining. PLD is the major virulence factor of C. pseudotuberculosis whereas the others are pointed as potential virulence factors. In silico characterization of these proteins were performed from predictions of physicochemical parameters, signal peptide, conserved domains, assessment of their conservation in eukaryotes and epitopes. In addition, the proteins were also expressed using a heterologous expression system in Escherichia coli and five different strains were tested for expression. By using the strains that showed the highest level of expression of each protein, we assessed the expression kinetics and solubility of the recombinant proteins. The PknG protein was successfully purified after an optimization step of the expression protocol that aimed to obtain the protein in the soluble fraction. Its purification was confirmed by Western blot. Following the purification of the other proteins we will now evaluate them regarding their antigenicity and protection against infection. Since virulence factors are important candidates for drug targets, diagnostic tests or even vaccine targets, obtaining these proteins is important to perform studies that may contribute to the development of a control strategy against LC. |
| Subject: | Corynebacterium pseudotuberculosis Linfadenite caseosa Escherichia coli Fatores de virulência Interações hospedeiro-patógeno Genética |
| language: | Português |
| Publisher: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Publisher Initials: | UFMG |
| Rights: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9UVNGZ |
| Issue Date: | 25-Aug-2014 |
| Appears in Collections: | Dissertações de Mestrado |
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