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http://hdl.handle.net/1843/SFSA-9MRRUQ
Tipo: | Tese de Doutorado |
Título: | Desenvolvimento de métodos de extração e derivatização para análises cromatográficas dos ácidos biliares e aminoácidos em estudos metabolômicos |
Autor(es): | Maria José Nunes de Paiva |
Primeiro Orientador: | Zenilda de Lourdes Cardeal |
Primeiro membro da banca : | Isabel Cristina Pereira Fortes |
Segundo membro da banca: | Rodinei Augusti |
Terceiro membro da banca: | Cristina Sanches Giraud |
Quarto membro da banca: | Isarita Martins Sakakibara |
Resumo: | Neste trabalho foram desenvolvidos e validados métodos cromatográficos para a quantificação de ácido biliares no plasma sanguíneo e aminoácidos no liquido cefalorraquidiano. Para a análise dos ácidos biliares e aminoácidos foram desenvolvidos métodos de preparo de amostras baseados na derivatização assistida por micro-ondas. Estas análises foram efetuadas por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas. A derivatização dos ácidos biliares foi realizada por meio da metoximação e sililação. O tempo de reação a potencia do micro-ondas e a quantidade de derivatizante foram otimizadas para um melhor rendimento analítico. A melhor condição obtida foi a adição de 40 µL de BSTFA com aquecimento a uma potencia de 210 W por 3 min. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 0,78 e 20,0 µg mL-1 e o intervalo da precisão variou de 1,08 a 9,32%. O método de análise para determinação dos aminoácidos, após a validação, foi aplicado em amostras reais de líquido cefalorraquidiano de pacientes hospitalizados com suspeita de infecção fungica. O planejamento experimental mostrou que o tempo de derivação ideal foi de 3 min na potencia de 210W. Os limites de detecção encontrados foram de 0,01 µmol L-1 a 4,21 µmol L-1 e os limites de quantificação foram de 0,02 µmol L-1 a 7,07 µmol L-1. A precisão intra-ensaio variou de 4,12 a 15,59% e a interensaio de 6,36 a 18,71%. Para os aminoácidos todos os coeficientes de determinação ficaram acima de 0,990. Em seguida foi desenvolvido um método para análise dos ácidos biliares no plasma. Para a extração dos ácidos biliares presentes no plasma foi desenvolvido um método de microextração em fase líquida com fibra oca. A análise foi feita utilizando a cromatografia líquida de alto desempenho acoplada à espectrometria de massas. A otimização do procedimento de LPME em duas fases para a extração dos ácidos biliares apresentou limites de detecção entre 2,07 e 2,66 nmol L-1 e limites de quantificação entre 10,35 e 13,20 nmol L-1. A precisão intra-ensaio variou de 3,3 a 11,9% e a para a concentração de 25,0 µg L-1 e de 2,1 a 8,3% para a concentração de 100,0 µg L-1. O método apresentou linearidade no intervalo de 10,35 a 531,0 nmol L-1. A metodologia desenvolvida e validada foi aplicada à análise de ácidos biliares em plasma de trabalhadores expostos à solventes, e em voluntários não expostos. Os métodos desenvolvidos mostraram-se adequados para todas as determinações feitas no plasma e no líquido cefalorraquidiano. O método para análise de aminoácido utilizando derivatização assistida por micro-ondas mostrou ser simples, rápido, sensível e seletivo. O método para análise dos ácidos biliares por microextração em fase líquida apresentou elevada sensibilidade, baixo consumo de solventes, e boa recuperação. |
Abstract: | This work presents the development and validation of chromatographicmethods for quantification of bile acid in blood plasma and amino acids in cerebrospinal fluid. Sample preparation methods based on microwave assisted derivatization were developed for analyzing bile acids and amino acids. The derivatization of bile acids was performed using the two-step process of methoximation and silylation. The reaction time, power and quantity of N,O-bis-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) + 1 % trimethylchlorosilane (TCMS) were optimized to improve the derivatization. The optimized derivatization conditions required 210 W for 3 min. The MAD method exhibited linearity with respect to cholic acid between 0.78 and 20.0 g mL-1 with an LOQ of 0.23 g mL-1 and a precision ranging from 1.08 to 9.32% CV. The amino acids samples were analyzed by gas chromatography with a mass spectrometric detector. The validated methodology for determination of amino acids was applied to real samples of cerebrospinal fluid from hospitalized patients with suspicion of fungical infection. The experimental design used to optimize the conditions showed that the optimal derivatization time was 3 min with a microwave power of 210 W. The sensitivity was very good, with limits of detection (LDs) ranging from 0.01 mol L1 to 4.24 mol L1 and limits of quantification (LQs) ranging from 0.02 to 7.07 mol L1. The precision, measured using the relative standard deviation (RSD), ranged from 4.12 to 15.59% for intra-day analyses and from 6.36 to 18.71% for inter-day analyses. The coefficients of determination (R2) were above 0.990 for all amino acids. Next, a hollow fiber-liquid phase microextraction method was developed for sampling and preconcentration of bile acids present in plasma samples. The analyses were performed by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The optimized two-phase LPME procedure for the extraction of bile acids showed limits of detection between 2.07 and 2.66 nmol L-1 and limits of quantification between 10.35 and 13.20 nmol L-1. The intra-assay precision ranged from 3.3 to 11.9% (25.0 mg L-1) and 2.1 to 8.3% at the concentration of 100.0 mg L-1. The developed method was linear over the range of 10.35 to 531.0 nmol L-1 for all analytes. The methodology was validated and applied to the analysis of bile acids in plasma of workers exposed to solvents, and volunteers not exposed. The developed methods shown to be appropriate for both determinations inplasma and cerebrospinal fluid. The amino acid method using microwave assisted derivatization shows to be suitable for bio monitoring analysis, easy, quick, sensitive, and selective. The method for bile acids analysis by hollow fiber liquid phase microextraction showed high sensitivity, low solvent consumption, and good recovery. |
Assunto: | Química analítica Aminoácidos Metabolismo Cromatografia de gás Ácidos Espectrometria de massa |
Idioma: | Português |
Editor: | Universidade Federal de Minas Gerais |
Sigla da Instituição: | UFMG |
Tipo de Acesso: | Acesso Aberto |
URI: | http://hdl.handle.net/1843/SFSA-9MRRUQ |
Data do documento: | 19-Dez-2013 |
Aparece nas coleções: | Teses de Doutorado |
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