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http://hdl.handle.net/1843/SFSA-A8XS4K| Tipo: | Dissertação de Mestrado |
| Título: | Mecanismo de catálise e dinâmica protéica da enzima salicilato hidroxilase |
| Autor(es): | Stefanya Velasquez Gomez |
| primer Tutor: | Tiago Antonio da Silva Brandao |
| primer miembro del tribunal : | Ronaldo Alves Pinto Nagem |
| Segundo miembro del tribunal: | Jarbas Magalhaes Resende |
| Resumen: | Neste trabalho buscou-se caracterizar a enzima salicilato hidroxilase (NaHG) de Pseudomas putida cepa G7 em relação a sua dinâmica proteica e mecanismo de catálise. Essa enzima participa da via de degradação do naftaleno, sendo uma monooxigenase flavodependente que catalisa, ao custo de NADH e O2, a descarboxilação oxidativa do ácido salicílico (AS)para originar catecol. A análise de dados estruturais obtidos por espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostrou que a NahG não ligada a FAD sofreu uma contração estrutural em relação a holoenzima.No mesmo sentido, a titulação fluorimétrica revelou que a ligação do FAD foi seguida por uma forte supressão da fluorescência em 340 nm e um aumento do rendimento quântico em 524 nm, sugerindo que resíduos de triptofano sofrem uma mudança de meio e próximos ao FAD produziram transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET). Na determinação de parâmetros cinéticos para a NahG observou-se que os valores de Km para FAD e O2são da ordem de concentração utilizadade enzima, indicando que a reação entre O2 e flavina para formar um complexo C4ahidroperoxiflavina foi altamente favorável. Desses resultadosobservou-se que a etapa determinante de velocidade de reação deve ser posterior a qualquer evento de formação da C4a-hidroperoxiflavina. Os dados cinéticos em função do pH para as enzimas nativas e mutantes H110N e H322Y indicam que duas isoformas catalisam a reação de descarboxilação oxidativa do ácido salicílico na NahG. A desprotonação ou mutação dos resíduos de histidina favorece a catálise, mas diminuem a afinidade da NahG pelo AS.Os perfis de Log kcat em função do pH mostram três constantes de ionização, duas dessas constantes foram atribuídas a H110 e ao grupo peroxila da C4ahidroperoxiflavina. Os estudos cinéticos com NahG nativa utilizando como substratos os ácidos salicílicos substituídos mostraram um formato curvo para o perfil de Hammett com Log kcat. Isso indicou mudança da etapa determinante da velocidade de reação, que ocorre por um mecanismo tipo substituição eletrofílica aromática (SEAr). |
| Abstract: | The goal of this study was to characterize the enzyme salicylate hydroxylase (NaHG) of Pseudomonas putida strain G7 regarding its protein dynamics and mechanism of catalysis. This enzyme is aflavine-dependent monooxygenase participating in the naphthalene degradation pathway at cost of NADH and O2 catalyzing the oxidative decarboxylation of salicylic acid (SA) to yield catechol. The analysis of the structural data obtained by small angle X-ray scattering (SAXS) showed that NahG unbound to FAD has undergone a structural contraction relative to the holoenzyme. Likewise, fluorimetric titration revealed that FAD binding was followed by strong suppression of the fluorescence at 340nm and increased of the quantum yield at 524 nm, suggesting that tryptophan residues underwent a change in their environment and near to FAD produced fluorescence resonance energy transfer (FRET). The Km values for FAD and O2 are within the order of enzyme concentration used in the experiment as determinated by kinetic parameters for NahG, indicating that the reaction between O2 and FAD to form the C4a-hydroperoxiflavine complex was highly favorable. These results suggested that the rate-determining step occur after any event of C4a-hydroperoxiflavine formation. The kinetic data as a function of pH for the native and mutants (H110N and H322Y)NahG indicatedthe participation of two isoforms in the catalysis of the oxidative decarboxylation reaction of salicylic acid. The deprotonation or mutation of these histidine residues promoted catalysis, whereas decreased the affinity of NahG by AS. The Log kcat-pH profiles showed three ionization constants, two of these constants were attributed to H110 and the peroxyl group of C4a-hydroperoxiflavine. Kinetic studies for substituted salicylic acids showed a curved Hammett profile for log kcat. This indicated change of the rate-determining step of the reaction, which occurs by an electrophilic aromatic substitution (SEAr)type mechanism. |
| Asunto: | Química Orgânica Catálise Proteinas Salicilatos Enzimas |
| Idioma: | Português |
| Editor: | Universidade Federal de Minas Gerais |
| Sigla da Institución: | UFMG |
| Tipo de acceso: | Acesso Aberto |
| URI: | http://hdl.handle.net/1843/SFSA-A8XS4K |
| Fecha del documento: | 3-nov-2015 |
| Aparece en las colecciones: | Dissertações de Mestrado |
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