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metadata.dc.type: Tese de Doutorado
Title: Sinais de tráfego envolvidos no envolvidos no endereçamento do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT)
metadata.dc.creator: Lucimar Teodoro Ferreira
metadata.dc.contributor.advisor1: Marco Antonio Maximo Prado
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Vania Ferreira Prado
metadata.dc.contributor.referee1: Silvia Carolina Guatimosim Fonseca
metadata.dc.contributor.referee2: Andre Ricardo Massensini
metadata.dc.contributor.referee3: ROBERTO PAES DE CARVALHO
metadata.dc.contributor.referee4: MARTIN PABLO CAMMAROTA
metadata.dc.description.resumo: O transportador vesicular de acetilcolilna (VAChT) é a proteína responsável pelo empacotamento de acetilcolina (ACh) citoplasmática em vesículas sinápticas de neurônios colinérgicos. A região C-terminal do transportador, que é voltada para o citosol, é importante nos eventos de tráfego intracelular e direcionamento para organelas secretórias. Neste estudo, nós procuramos identificar os sinais de tráfego presentes nessa região. Utilizando a GFP (proteína fluorescente verde) como etiqueta molecular e a microscopia confocal, o tráfego intracelular de diversas construções do VAChT, com mutações e deleções, foi avaliado. Nossos resultados sugerem que os aminoácidos 471-490 contém sinais importantes para a saída do retículo endoplasmático, endocitose, tráfego e direcionamento do VAChT para synaptic like microvesicles (SLMVs). Entre os resíduos 481-485 parece existir um sinal de exportação do retículo endoplasmático, uma vez que a mutação destes aminoácidos levou à retenção do transportador neste compartimento. A mutação do motivo di-leucina, presente nas posições 485 e 486, leva à um acúmulo do transportador na membrana plasmática. Experimentos de interação proteína-proteína mostraram que a região C-terminal do VAChT interage com a subunidade do complexo adaptador de clatrina AP-2, de uma maneira dependente do motivo baseado em leucina. Com o intuito de avaliarmos o papel da clatrina no tráfego e endocitose do VAChT, utilizamos a construção AP180-C que, quando superexpressa, bloqueia a endocitose de proteínas que dependem de clatrina. Estes experimentos demonstraram que a endocitose mediada por clatrina é um evento essencial para o tráfego do VAChT. Além disso, nossos resultados também demonstraram que os aminoácidos envolvidos na interação com a maquinaria endocítica estão presentes na sequência compreendida entre os resíduos 471-490 da região C-terminal do transportador. Nosso próximo passo foi tentar identificar proteínas que interagem com o VAChT e auxiliam no seu tráfego e direcionamento para as vesículas sinápticas. Para isso, realizamos a varredura de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano. A interação entre VAChT e SEC14like foi detectada neste sistema, e confirmada através de co-imunoprecipitação. SEC14 é uma proteína envolvida com tráfego de vesículas e na transferência de fosfatidilinositol e fosfatidilcolina entre membranas. Experimentos de co-localização, sugerem não apenas que VAChT e SEC14 se co-localizam, como também que a distribuição subcelular do transportador parece estar alterada na presença de SEC14. Outros estudos ainda precisam ser realizados para avaliar a implicação da superexpressão de SEC14like no tráfego do VAChT. Os resultados deste trabalho sugerem fortemente que, existe um sinal de exportação do retículo endoplasmático entre os aminoácidos 481-485, o motivo baseado em leucina é o responsável pela interação entre o VAChT e AP-2, a endocitose mediada por clatrina tem um papel fundamental na endocitose e tráfego do transportador e que a superexpressão de SEC14like parece interferir no tráfego do VAChT.
Abstract: The vesicular acetylcholine transporter (VAChT) is the protein responsible for packaging cytoplasmic acetylcholine (ACh) into the synaptic vesicle of cholinergic neurons. The cytosolic C-terminal region of VAChT is important in intracellular trafficking events and targeting to secretory organelles. In this study, we evaluate the existence of trafficking signals in this region. Using confocal microscopy and GFP (green fluorescent protein) as a molecular label, the intracellular trafficking of several VAChT constructs was observed. Our results suggest that amino acids 471-490 contain important signals for endocytosis, trafficking, endoplasmic reticulum (ER) export and the targeting of VAChT to synaptic like microvesicles (SLMVs). In the region comprehended by residues 481-485 seems to exist a signal for endoplasmic reticulum export since the mutation of these amino acids retains the transporter in the ER. Mutation of the di-leucine motif (L485 L486) relocates the transporter to the soma plasma membrane. Protein-protein interaction experiments demonstrated that the C-terminal region of VAChT interacts with subunit of clathrin adaptor complex AP2 in a di-leucine motif dependent manner. To evaluate the role of clathrin in the trafficking and endocytosis of VAChT, we used the AP180-C construct. When AP180-C is overexpressed the clathrin-mediated endocytosis is blockade. These experiments demonstrated that clathrin mediated endocytosis is an essential event for VAChT trafficking. In addition, our results showed that the amino acids involved in the interaction with the clathrin endocytic machinery are present in the sequence between residues 471-490 of the C-terminal region of VAChT. In our next step, we tried to identify proteins that interact with VAChT and contribute in its trafficking and sorting to synaptic vesicles. For this reason, we performed a screening in a human brain cDNA library. The interaction between VAChT and SEC14like was detected in this system and was confirmed by co-immunoprecipitation. SEC14 is implicated in vesicle trafficking and in phosphatidylinositol and phosphatidylcholine transfer between membranes. Co-localization experiments suggest not only that VAChT and SEC14like co-localize but also that the subcellular distribution of VAChT appears to be altered in the SEC14 presence. Further studies must be performed to verify the implications of SEC14like overexpression on VAChT trafficking. Our results strongly suggest that: 1- there is an ER export signal between amino acids 481-485; 2- the di-leucine motif is responsible for VAChT interaction with AP2; 3- the clathrin dependent endocytosis has a fundamental role in endocytosis and trafficking of the transporter; and 4- the overexpression of SEC14like seems to interfere with VAChT trafficking.
metadata.dc.subject.other: Acetilcolina Receptores
Vesículas transportadoras
Farmacologia
Endocitose
Vesículas sinápticas
metadata.dc.language: Português
Publisher: Universidade Federal de Minas Gerais
metadata.dc.publisher.initials: UFMG
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://hdl.handle.net/1843/SMOC-6Y6N55
Issue Date: 17-Apr-2006
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