Efeito da adição de Aniba Canelilla, Blueberry e Polifenol de chá verde sobre a viabilidade in vitro de espermatozóides de Búfalo (Bubalus Bubalis) resfriados a 5º C.

Veronica Alexandra Becerra Becerra

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Type:	Dissertação de Mestrado
Title:	Efeito da adição de Aniba Canelilla, Blueberry e Polifenol de chá verde sobre a viabilidade in vitro de espermatozóides de Búfalo (Bubalus Bubalis) resfriados a 5º C.
Authors:	Veronica Alexandra Becerra Becerra
First Advisor:	Marc Roger Jean Marie Henry
First Referee:	Mariana Machado Neves
Second Referee:	Gabriel Augusto Monteiro
Abstract:	O aumento das espécies reativas ao oxigênio (ERO) gera o estresse oxidativo e causa efeitos deletérios aos espermatozoides no sêmen refrigerado, congelado e descongelado. O uso de antioxidantes não enzimáticos no meio diluidor, pode preservar os espermatozoides da ação negativa das ERO durante o processo de criopreservação. O objetivo deste trabalho foi determinar concentrações apropriadas dos antioxidantes não enzimáticos Aniba canelilla, blueberry e polifenol e chá verde no meio à base tris 10% LDL e testar sua eficiência sobre a longevidade e viabilidade espermática de sêmen de búfalo preservado a 5°C. Este trabalho foi dividido em duas fases. Ejaculados de 9 machos bubalinos foram usados com cada antioxidante. As amostras da fase 1 e 2 foram analisadas pelo CASA antes do resfriamento e a cada 24 horas após resfriamento até a motilidade espermática total decrescer até 10%. A integridade funcional da membrana plasmática foi analisada mediante teste hiposmótico em sêmen fresco e às 24 e 48 horas na fase 1; e às 24 e 72 horas na fase 2. Adicionalmente, as amostras da fase 2 foram submetidas ao teste de integridade acrossomal realizado em sêmen fresco e às 24 e 72 horas; mediante citometria de fluxo avaliou-se a integridade estrutural da membrana e a integridade da cromatina às 24 e 72 horas de resfriamento. O delineamento experimental usado foi em blocos ao acaso, os dados foram avaliados pelo método dos quadrados mínimos, utilizando o pacote PROC MIXED do programa SAS versão 6.12. Para as variáveis que após transformação de dados ainda não atendiam a homocedasticidade de variâncias, utilizou-se o teste não paramétrico de Friedman com o programa InfoStat (2014). A significância estatística foi considerada quando P 0.05. Na fase 1 determinou-se na incubação de sêmen de búfalos a 5°C, a concentração mais adequada de Aniba canelilla (0.5, 5 e 50 µg/ml), blueberry (10, 50 e 100 µg/ml) e polifenol de chá verde (0,05; 5 e 50 µg/ml) adicionados ao meio à base tris 10% LDL. As concentrações elegidas foram Aniba canelilla 50µg/ml, blueberry 50 µg/ml e polifenol de chá verde 0,05µg/ml por apresentar melhores respostas (P0.05) na cinética espermática e/ou por mostrar inocuidade aos espermatozoides de búfalos. A adição de 50µg/ml de polifenol de chá verde ao meio diluidor Tris 10% LDL, teve consequências negativas na motilidade, funcionalidade da membrana plasmática e sobrevivência dos espermatozoides de búfalos. Na fase 2 foi comparada a eficiência da melhor concentração dos antioxidantes testados na primeira fase. O meio diluidor Aniba canelilla 50µg/ml tris 10% LDL promoveu a melhora da cinética espermática (P 0.05) nos parâmetros motilidade total (MT), MP, Rápidos, VCL, VSL, VAP e BCF. Além de prolongar a longevidade espermática ao ter maior número de amostras com MT às 120 horas de refrigeração a 5°C. Em relação aos parâmetros avaliados, integridade funcional e estrutural da membrana plasmática, integridade do acrossoma, integridade da cromatina não houveram diferenças significativas entre tratamentos. Conclui-se que Aniba canelilla poderá ser de considerável ajuda se ajustadas as concentrações nos meios diluidores, tanto para sêmen bubalino como para outras espécies. Há necessidade de serem realizadas mais avaliações de cada substância a fim de obter um ganho na preservação de espermatozoides e protege-los do estresse oxidativo sem afetar a fertilidade.
Abstract:	The increase of reactive oxygen species (ROS) generates oxidative stress, which causes harmful effects to spermatozoa in cooled, frozen and post thaw procedures. The use of non-enzymatic antioxidants in extenders, could preserve the spermatozoa from negative action of ROS during the cryopreservation process. The aim of this study was to determine appropriate concentrations of non-enzymatic antioxidants Aniba canelilla, blueberry and green tea polyphenol in the extender Tris with 10% LDL, and test their efficiency on spermatozoa viability and longevity in buffalo semen preserved at 5°C. This work was divided into two phases. Ejaculates of nine buffalo bulls were used to test each antioxidant. Samples of phase 1 and 2 were analyzed by CASA before refrigeration and every 24 hours after refrigeration until total sperm motility decreased to 10%. The functional plasma membrane integrity was analyzed by hypoosmotic swelling test in fresh semen, 24 and 48 hours in phase 1; 24 and 72 hours in phase 2. Additionally, samples of phase 2 were analyzed by acrosome integrity on fresh semen, 24 and 72 hours; and by flow cytometry to evaluated structural plasma membrane integrity and sperm chromatin integrity at 24 and 72 hours after cooling. The experimental design used was a randomized block, the data were analyzed by the least squares method using the PROC MIXED of program SAS - version 6.12. For variables that after transformation of data did not satisfy the homoscedasticity of variances, it was used the non-parametric Friedman test with the program InfoStat (2014). Differences were considered to be statistically significant when P0.05. In phase one it was determined the best concentration of Aniba canelilla (0,5; 5 or 50 µg/ml), blueberry (10, 50 e 100 µg/ml) and green tea polyphenol (0,05; 5 or 50 µg/ml) added to the extender Tris 10% LDL. The elected concentrations were for Aniba canelilla 50µg/ml, blueberry 50 µg/ml and green tea polyphenol 0,05ìg/ml based on results of spermatic kinetics (P0.05) and/or based on their innocuous results for buffalo spermatozoa. The addition of 50 ug/ml of green tea polyphenol to the extender Tris 10% LDL exerted negative consequences on motility, plasma membrane integrity and survival of sperm buffalo. In phase two the efficiency of the best concentrations of the antioxidants tested in phase one was compared. In phase 2 the extender Tris 10% LDL supplemented with Aniba canelilla 50 µg/ml lead to the improvement of spermatic kinetic parameters (P0.05) such as total motility (TM), PM, Rapid, VCL, VSL, VAP and BCF; besides preserving spermatic longevity in buffalo semen cooled at 5°C for a long period. Functional and structural plasma membrane integrity, acrosome integrity, chromatin integrity did not significantly differ between treatments. It is concluded that Aniba canelilla may be of considerable help for buffalo semen and for other species if the concentrations are adjusted to the extenders. More assessments of each substance are needed in order to obtain a gain in sperm preservation and protect them from oxidative stress without affecting fertility.
Subject:	Bufalo Reprodução Sêmen Criopreservação Espécies reativas de oxigênio Estresse oxidativo Antioxidantes
language:	Português
Publisher:	Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials:	UFMG
Rights:	Acesso Aberto
URI:	http://hdl.handle.net/1843/SMOC-AQHPNS
Issue Date:	10-Apr-2017
Appears in Collections:	Dissertações de Mestrado

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