Análise de splicing alternativo durante o processo de amadurecimento de frutos: aplicação em café e tomate
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Alternative splicing analysis during fruit ripening: application in coffee and tomato
Primeiro orientador
Membros da banca
Glória Regina Franco
José Miguel Ortega
Mariana Lima Boroni Mar ns
Sérgio Vale Aguiar Campos
Jose Cleydson Ferreira Silva
José Miguel Ortega
Mariana Lima Boroni Mar ns
Sérgio Vale Aguiar Campos
Jose Cleydson Ferreira Silva
Resumo
O Splicing Alternativo (AS) é um mecanismo cotranscricional que habilita o eucarioto
estender seu proteoma mesmo com uma quantidade limitada de genes. A maquinaria
celular realiza o AS pela combinação de regiões alternativas das isoformas, tanto em
transcritos produtivos quanto em não produtivos. Os eventos de AS podem ser
preditos com dados de RNASeq. Em plantas o evento mais frequente é o intron
retention (IR) que pode ter efeito regulatório, por exemplo, ao inserir um códon de
parada prematuro (PTC) que leva a degradação do transcrito pela via nonsense-
mediated decay (NMD). Para estudar potenciais eventos de AS no processo biológico
de amadurecimento de grãos de café e tomate conduzimos um estudo de diferencial
AS (DAS) utilizando dados de RNASeq obtidos para experimento de expressão
diferencial e o genoma de referência para identificar DAS. Para isso, nós
desenvolvemos pipelines em Python afim de realizar uma curadoria automatizada dos
202 genes alvo que foram identificados pelo rMATS em 241 eventos de DAS nos
contrastes de frutos verde com estágio intermediário de amadurecimento (yellow), e,
maduro com yellow. Realizamos em seguida uma curadoria manual dos 241 eventos
enriquecidos com a anotação do Interproscan5 que levou ao interesse de validar
experimentalmente os genes Potassium channel AKT1 e Apyrase 7 com auxílio de
PCR e qPCR. Os desafios identificados durante as análises de AS em dados de
RNASeq nos induziram a desenvolver um aplicativo de interface amigável para
explorar dados de DAS por RNASeq. O aplicativo foi desenvolvido composto de três
módulos GeneAPPScript, GeneAPPServer, GeneAPPExplorer. O modulo
GeneAPPScript é um wrapper poderoso que permite executar uma análise completa
de DAS desde a obtenção dos dados em rede até a anotação funcional dos genes
sob DAS. Esse modulo pode ser executado em distros Debian, como no ambiente
Google Colaboratory (Colab) onde foi desenvolvido. Já o modulo GeneAPPServer é
um backend Flask que permite integrar saídas de diferentes softwares de análise de
DAS que geram dados em outputs tabulares. Usando o GeneAPPExplorer o usuário
pode gerar dezenas de gráficos para visualizar graficamente importantes resultados
implícitos nas tabelas técnicas exportadas pelos softwares de análises de DAS. Além
disso pelo webapp o pesquisador tem acesso a tabelas enriquecidas de dados de
anotação funcional, estrutural e atributos dos eventos. O GeneAPP tem potencial de
contribuir na análise de AS em vários outros trabalhos depositados em bancos de
dados públicos onde só foi analisado expressão diferencial no nível de gene,
permitindo expandir o entendimento dos mecanismos moleculares e explorar o
transcriptoma no nível de isoformas.
Abstract
Alternative Splicing (AS) is a co-transcriptional mechanism that enables the eukaryote
to extend its proteome even with a limited number of genes. The cellular machinery
performs AS by combining alternative regions of the isoforms in both productive and
non-productive transcripts. AS events can be predicted using RNASeq data. In plants,
the most frequent event is the retention of introns (IR) that can have a regulatory effect,
for example, inserting a premature stop codon (PTC) that leads to degradation of the
transcript through the nonsense-mediated decay (NMD) pathway. To study potential
AS events in the biological process of coffee bean and tomato ripening, we conducted
a DAS study using RNASeq data obtained for differential expression experiment and
the referential coffee genome to identify differential AS (DAS). For this, we developed
pipelines in Python to perform an automated curation of the 202 target genes that were
identified with 241 DAS events by rMATS in the comparisons of early green fruits,
intermediate yellow and final red ripening stage. We then carried out a manual curation
of the 241 events enriched with the Interproscan5 annotation with further
experimentally validating of Potassium channel AKT1 and Apyrase 7 genes under
differential alternative expression during coffee grain ripening using conventional PCR
and qPCR. Due to challenges identified during this analysis associated with the
relationship of AS events and RNASeq data processing, we built an application of user-
friendly APP to predict AS in RNASeq data. The application development is composed
of three modules named GeneAPPScript, GeneAPPServer, GeneAPPExplorer. The
GeneAPPScript module is a powerful wrapper that enables to perform a complete DAS
analysis from obtaining network data to functional annotation of genes under DAS.
This module can run on Debian distros, such as the Google Collaboratory (Colab)
environment where it was developed. The GeneAPPServer module is a Flask backend
that allows you to integrate outputs from different DAS analysis software that generate
data in tabular outputs. Using GeneAPPExplorer, the user can generate dozens of
graphs to graphically visualize important results implicit in technical tables exported by
DAS analysis software. In addition, through the webapp, the researcher has access to
tables enriched with functional and structural annotation data and event attributes.
GeneAPP will contribute to the analysis of AS in several other works deposited in public
databases where only differential expression at the gene level was analyzed, allowing
further explanation when exploring the transcriptome at the isoform level.
Assunto
Bioinformática, Café, Lycopersicon esculentum, Processamento Alternativo
Palavras-chave
Amadurecimento, Café, Splicing Alternativo, Tomate, Webapp, Geneapp