One-Step RT-qPCR assay for detection and quantification of equine infectious anemia virus in-vitro

Abstract

A infecção pelo vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) geralmente resulta em uma resposta febril inicial, seguida por ciclos recorrentes da doença e, finalmente, um período assintomático prolongado. Essas variações nos sinais clínicos são devidas a vários fatores, incluindo cepa do vírus, espécies de equídeos e diferenças de suscetibilidade entre os animais. Como consequência da estreita relação entre cepa viral e doença, estudos sobre replicação in vitro e adequação de EIAV em macrófagos, que são as células-alvo do vírus, dependem da medição precisa da carga viral ao longo do período de infecção. Desenvolvemos um método para quantificar o EIAV in vitro usando um sistema de RT-qPCR de uma etapa a partir de um RNA de controle sintetizado para essa finalidade. Os primers projetados amplificaram um fragmento de 520 pares de bases da região do gene gag que foi inserido em um plasmídeo pGEM-T Easy Vector e propagado em Escherichia coli DH5-α. As bactérias com a construção foram propagadas e foram produzidas quantidades suficientes do DNA molde. O RNA foi sintetizado in vitro a partir do produto de linearização do plasmídeo e foi usado para padronização de um sistema de RT-qPCR de uma etapa com um limite mínimo de detecção de 10 a 15 moléculas. A eficiência da reação foi de 101%, com r2 igual a 0,997. Este novo método pode ser usado para a determinação do título do vírus em estudos de replicação de EIAV in vitro.