Desenvolvimento e caracterização de córneas humanas descelularizadas e recelularização com células-tronco visando regeneração do epitélio corneano anterior
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Primeiro orientador
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Carlos Magno da Costa Maranduba
Giselle Foureaux Heida
Joel Edmur Boteon
Niels Olsen Saraiva Câmara
Giselle Foureaux Heida
Joel Edmur Boteon
Niels Olsen Saraiva Câmara
Resumo
A córnea pode ser afetada por uma série de doenças que levam à deficiência visual e à cegueira. O único tratamento para a maioria destas doenças consiste no transplante de córnea. Entretanto, esse procedimento apresenta algumas desvantagens, dentre as quais as duas mais relevantes são a escassez de doadores e o risco de rejeição do enxerto. Nesse contexto, o desenvolvimento de córneas artificiais com base em métodos de descelularização representa uma alternativa promissora para contornar os problemas relacionados ao transplante de córnea. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi desenvolver e caracterizar córneas humanas descelularizadas, colonizar a membrana basal dessas córneas com células-tronco e promover a diferenciação das mesmas em células do epitélio corneano (CECs) utilizando meio indutor suplementado com soro humano. Para tanto, as córneas foram descelularizadas por dois diferentes métodos: 1) tratamento com NaCl, 2) tratamento com NaCl + Nucleases. A total remoção dos componentes celulares assim como a integridade da matriz extracelular das córneas descelularizadas (CDs) foram avaliadas por meio de análises histológicas, microscopia eletrônica de varredura e transmissão, quantificação de DNA genômico, imunofluorescência e marcação nuclear com a sonda Hoechst. Posteriormente, as CDs foram recelularizadas com células-tronco humanas isoladas das bolsas de gordura da pálpebra (OFSCs), células-tronco embrionárias (hESCs) ou células-tronco de pluripotência induzida (hiPSCs) e a biocompatibilidade das CDs foi analisada por meio do ensaio de Calceína-AM. Avaliou-se a capacidade das OFSCs, hESCs e hiPSCs em se diferenciar em CECs quando cultivadas sobre as CDs ou laminina na presença de meio de cultura suplementado com soro humano em substituição ao soro fetal bovino. Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento apenas com NaCl resultou em remoção incompleta dos componentes celulares. Em contraste, verificou-se completa remoção das células, núcleos, fragmentos celulares e DNA nas córneas submetidas ao tratamento com NaCl + Nucleases. Além disso, esse tratamento preservou a composição e ultraestrutura da matriz extracelular das CDs, as quais suportaram a adesão e cultivo das OFSCs, hESCs e hiPSCs. As OFSCs não foram capazes de se comprometer com a linhagem de CECs, enquanto as hESCs e hiPSCs alcançaram um fenótipo epitelial corneano mais maduro quando cultivadas sobre a membrana basal das CDs do que quando cultivadas sobre a laminina. Os achados do presente estudo demonstraram que o tratamento das córneas humanas com NaCl + Nucleases resultou em uma matriz completamente descelularizada e biocompatível com propriedades estruturais e funcionais preservadas com potencial aplicação na engenharia de tecidos da córnea
Abstract
Numerous diseases can affect corneal structure, leading to visual impairment and even
blindness. Currently, the only treatment for most corneal illnesses is transplantation of corneal
allografts. However, graft rejection and the lack of donors are the two major disadvantages
associated to this procedure. Generation of artificial corneas based on decellularization
methods is a promising alternative to overcome these problems. Therefore, the present study
aimed to develop and characterize decellularized human corneas, recellularize these
decellularized corneas (CDs) with human stem cells and promote the differentiation of these
cells into corneal epithelial-like cells (CECs) in culture medium supplemented with allogeneic
human serum (SH) replacing fetal bovine serum. Two decellularization protocols were tested:
1- sodium chloride (NaCl) treatment, 2 - NaCl plus nucleases treatment. The success of each
method on the removal of cells from the cornea and the integrity of the extracellular matrix
were investigated by histology, electron microscopy, DNA quantification,
immunofluorescence and nuclear staining with Hoechst. The CDs were recellularized with
human orbital fat-derived stem cells (OFSCs), human embryonic stem cells (hESCs), or
human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and the biocompatibility of the CDs was
analyzed by calcein-AM staining. The ability of the OFSCs, hESCs and hiPSCs to
differentiate into CECs when cultured on CDs or on laminin in culture medium supplemented
with SH was evaluated. The results showed that corneas processed using NaCl resulted in
incomplete removal of cellular material. In contrast, corneas decellularized with NaCl plus
nucleases method resulted in total removal of the cellular components. This treatment also
kept the epithelial basement membrane and stroma completely intact. Calcein-AM staining
demonstrated the viability, adhesion and a normal morphology of the OFSCs, hESCs and
hiPSCs seeded on CDs. OFSCs did not differentiate towards the CECs lineage, while hESCs
and hiPSCs differentiated into terminally differentiated CECs when seeded on CDs. These
results showed that NaCl plus nucleases treatment of human corneas generates an acellular
and biocompatible matrix with adequate histologic properties which have potential
applications in corneal tissue engineering.
Assunto
Biologia Celular, Córnea, Células-Tronco, Epitélio Anterior
Palavras-chave
Biologia Celular
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