A expressão de SOX3 modula as vias de apoptose e transição epitélio-mesênquima em carcinoma ductal invasivo de mama humano
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Mauro Cunha Xavier Pinto
Paula Peixoto Campos Lopes
Fabiana Alves
Marina Goncalves Diniz
Paula Peixoto Campos Lopes
Fabiana Alves
Marina Goncalves Diniz
Resumo
O câncer de mama é uma das doenças que mais matam mulheres em todo o mundo. Por ser
considerado uma doença complexa e com comportamento dinâmico, é necessário a busca de
novos marcadores tumorais e de alvos terapêuticos. As proteínas que atuam como fatores de
transcrição tem sido alvo de estudo nas neoplasias pelo seu importante papel na transcrição de
genes que codificam proteínas oncogênicas ou supressoras tumorais. Dentre os fatores de
transcrição importantes no destino da diferenciação celular e do processo de desenvolvimento
dos órgãos e tecidos, as proteínas da família SOX tem se destacado como alvo no estudo das
neoplasias, dentre elas a proteína SOX2 e SOX14, membros do mesmo subgrupo da proteína
SOX3, ainda pouco estudada. Com o objetivo de estudar o papel da proteína SOX3 na regulação
da apoptose e da transição epitéliomesênquima
(TEM) em neoplasias mamarias, a linhagem
celular MDAMB213,
proveniente de carcinoma ductal invasivo de mama, foi selecionada
como modelo experimental por não expressar a proteína SOX3, e apresentar um fenótipo mais
agressivo (Triplonegativo).
Portanto, para cumprir o objetivo do presente trabalho, a região
que codifica a proteína SOX3 humana foi subclonada no vetor de expressão pEF1/MycHis
usando uma sequência SOX3 amplificada a partir de DNA genômico humano. As células
MDAMB231
foram cultivadas e transfectadas com o vetor pEF1/MycHis/
SOX3, e como
controle foram utilizadas células sem tratamento e células transfectadas com vetor vazio
pEF1/MycHis.
Após 24 horas da transfecção, foi avaliado a citotoxicidade por teste de
viabilidadeMTT,
a porcentagem de células em apoptose por citometria de fluxo usando o
protocolo de Anexina VFITC/
PI, e a expressão dos genes envolvidos na apoptose e na TEM
por qPCR: SOX3, CASP3, CASP8, CASP9, BAX e BCL2, ECAD, NCAD, SNAIL, ZEB1 e ZEB2.
Os resultados indicaram uma redução de 55% da viabilidade das células transfectadas com
pEF1/MycHis/
SOX3, em relação aos seus controles, corroborando com os resultados da
porcentagem de apoptose por citometria de fluxo nas células transfectadas com pEF1/MycHis/
SOX3 (52%) quando comparados ao controle não transfectado (10%) e ao vetor vazio
(13%). Os resultados da qPCR indicaram maior expressão gênica de CASP3 (3,26 vezes),
CASP8 (2,24 vezes), CASP9 (18,54 vezes), BAX (4,11 vezes) e, menor expressão gênica de
BCL2 (0,40 vezes) em comparação com o controle não transfectado. Já a avaliação dos genes
relacionados a TEM demonstraram menor expressão de mRNA de NCAD (0,06 vezes), SNAIL
(0,18 vezes), ZEB1 (0,15 vezes), ZEB2 (0,11 vezes) e uma maior expressão de ECAD (27
vezes). Deste modo, os resultados do presente estudo suportam a hipótese de que SOX3 é um
fator de transcrição com envolvimento na regulação dos genes próapoptóticos
e do fenótipo
epitelial, com possível ação supressora de tumor, e a perda da sua expressão é um indicativo de
resistência a apoptose e de favorecimento da TEM. Futuros estudos funcionais, assim como a
investigação da expressão dessa proteína em tecidos de tumor de mama, correlacionados as
características clínicas e de prognóstico tumoral, devem ser realizados para melhor elucidar o
papel dessa proteína no câncer de mama.
Abstract
Breast cancer is one of the diseases that kill most women worldwide. It is considered a complex
disease with dynamic behavior, it is necessary to search for new tumor markers and therapeutic
targets. Proteins that act as transcription factors have been studied in neoplasms due to their
important role in the transcription of genes that encode oncogenic proteins or tumor
suppressors. Among the transcription factors important in the cell fate, differentiation, and
organ and tissues development, the SOX family proteins have been highlighted as a target in
the study of cancer, among them SOX2 and SOX14, members of the same subgroup of the
SOX3 protein, still little studied. To study the role of the SOX3 protein in the regulation of
apoptosis in the epitheliummesenchymal
transition (EMT) in mammary neoplasms, the cell
line MDAMB213,
from invasive ductal breast carcinoma, was selected as an experimental
model because it does not express the protein SOX3, and show a more aggressive phenotype
(Triplenegative).
Therefore, to fulfill this objective, the region encoding the human SOX3
protein was subcloned into the pEF1/MycHis
expression vector using a SOX3 sequence
amplified from human genomic DNA. MDAMB231
cells were cultured and transfected with
the pEF1/MycHis/
SOX3 vector, and untreated cells and cells transfected with empty
pEF1/MycHis
vector were used as controls. After 24 hours of transfection, cytotoxicity was
evaluated by viability testMTT,
the percentage of cells undergoing apoptosis was determined
by flow cytometry using the Annexin VFITC/
PI protocol, and qPCR was performed to evaluate
gene expression of apoptotic and epithelialmesenchymal
pathways: SOX3, CASP3, CASP8,
CASP9, BAX, BCL2, ECAD, NCAD, SNAIL, ZEB1 and ZEB2. Results indicated a reduction of
55% in cells transfected with pEF1/MycHis/
SOX3 viability, in relation to their controls,
corroborating the results of the percentage of apoptosis by flow cytometry in cells transfected
with pEF1/MycHis/
SOX3 (52%) when compared to the untransfected control (10%) and the
empty vector control (13%). Realtime
PCR results for apoptosisrelated
genes demonstrated
upregulation of mRNA expression of CASP3 (3.26fold),
CASP8 (2.24fold),
CASP9 (18.54fold)
BAX (4.11fold),
and downregulation of BCL2 mRNA expression (0.40fold)
compared
to the untransfected control. The evaluation of genes related to the epitheliummesenchymal
transition showed downregulation of NCAD (0.06fold),
SNAIL (0.18fold),
ZEB1 (0.15fold),
ZEB2 (0.11fold),
mRNA expression, and upregulation of ECAD mRNA expression (27fold).
Thus, the present study results support the hypothesis that SOX3 is a transcription factor
involved in the regulation of proapoptotic
genes and epithelial phenotype maintenance, with a
possible tumor suppressor action. So, the loss of its expression indicates resistance to apoptosis
and favoring EMT. Future functional studies and the investigation of the expression of this
protein in breast tumor tissues, correlated with clinical characteristics and tumor prognosis,
should be performed to better elucidate the role of this protein in breast cancer.
Assunto
Patologia, Neoplasias da Mama, Fatores de Transcrição, Fatores de Transcrição SOXB1, Apoptose
Palavras-chave
Câncer de mama, Fatores de Transcrição, SOX3, Apoptose, MDA-MB-231