Otimização da análise de imagem para estimar o tamanho do repasto de Lutzomyia longipalpis (Diptera; Phlebotominae) e avaliação do Parafilm® tratado em alimentador artificial
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Denise Barguil Nepomuceno
Kelsilândia Aguiar Martins
Kelsilândia Aguiar Martins
Resumo
Os flebotomíneos constituem um importante grupo de dípteros hematófagos, pois atuam
como vetores dos agentes causadores da leishmaniose em humanos, animais domésticos e
silvestres. O estabelecimento de colônias produtivas de flebotomíneos, é de particular
importância para sanar as muitas lacunas da sua biologia e da interação parasito-vetor. Um
ponto importante para a manutenção dos flebotomíneos é a oferta do repasto sanguíneo às
fêmeas, seja in vivo, a partir do uso de animais de laboratório, ou in vitro, utilizando alimentador
artificial. Mesmo na alimentação artificial é frequente a necessidade do uso tecidos ou órgãos
de animais como membrana de alimentação, atuando como a interface inseto-sangue. Para
flebotomíneos, a membrana mais comumente utilizada é a pele de pintinho (Gallus gallus
domesticus). Contudo, a redução do uso de cobaias no processo de alimentação dos insetos em
laboratório, é desejável. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o uso da
membrana Parafilm® tratada com Plasma gel na alimentação artificial de Lutzomyia longipalpis
(Diptera, Psychodidae) e estabelecer um protocolo de processamento de imagens para estimar
o tamanho do repasto sanguíneo dos flebotomíneos (in vitro e in vivo). Foram utilizadas, durante
os ensaios de alimentação, fêmeas de flebotomíneos com 3 à 6 dias de idade pós emergência
para o estágio adulto. Para alimentação in vitro, foi utilizado o aparelho Hemotek (Hemotek
Ltd.). Foram utilizadas três membranas: i) Membrana de pele de pinto (controle positivo - C+);
ii) Parafilm® M sem tratamento (controle negativo - C
-
) e iii) Parafilm® M tratado com Plasma
gel (Plasma gel – PG). Os testes de alimentação in vivo foram realizados com hamsters
anestesiados (hamster – H). A alimentação dos insetos foi avaliada pela porcentagem de fêmeas
que se alimentaram e pelo volume do repasto sanguíneo estimado, utilizando a dosagem de
hemoglobina (teste bioquímico) e/ou a área do abdômen (análise de imagem). Nos testes de
alimentação foram avaliadas um total de 1889 fêmeas, sendo que destas, 969 se alimentaram
(57,03%). A análise conjunta de todos os grupos experimentais (C-, C+, PG e H) mostrou que
a idade das fêmeas influenciou na performance alimentar dos insetos. Quanto maior o período
pós emergência, maior foi a porcentagem de fêmeas alimentadas e menor o tamanho do repasto.
Porém quando se comparou os resultados alcançados com fêmeas das 4 idades avaliadas (3 a 6
dias) entre os grupos experimentais, o tamanho do repasto sanguíneo foi semelhante, mas a
proporção de insetos alimentados foi diferente entre eles, sendo que a ordem da porcentagem
de insetos alimentados foi H (83,0%) > C+ (69,1%) >PG (51,4%) > C- (12,9%). A comparação
entre a dosagem de hemoglobina e a análise de imagem baseou-se nos resultados obtidos a
partir da análise de 1053 fêmeas. Dentre eles, as estimativas da largura (corte= 0,59 mm) e da
área abdominal (corte= 0,73 mm²) foram as que apresentaram o melhor desempenho quando
comparados com a dosagem de hemoglobina, apresentando uma convergência na capacidade
de caracterizar as fêmeas em alimentadas e não alimentadas de 94,0 e 93,5%, respectivamente.
Quando a largura e a área abdominal foram analisadas em função da variação do volume de
sangue estimado pela dosagem de hemoglobina, ambas apresentaram uma alta correlação, com
R
2 = 0,84 e 0,85, respectivamente.
Abstract
Sandflies constitute an essential group of blood-sucking dipterans, as they act as vectors of the
causative agents of leishmaniasis in humans and domestic and wild animals. Establishing
productive sandfly colonies is vital to understanding the many gaps in their biology and
parasite-vector interaction. An essential point for the maintenance of sandflies is the offer of
blood meal to females, either in vivo, using laboratory animals, or in vitro, using an artificial
feeder. In artificial feeding, it is necessary to use animal tissues or organs as feeding membrane
that acts at the insect-blood interface. The most used membrane for sandflies is chick skin
(Gallus gallus domesticus). However, reducing the use of animals in the process of feeding
insects in laboratory is desirable. In this sense, the objective of the present work was to evaluate
the use of Parafilm® M membrane treated with Plasma gel in the artificial feeding of Lutzomyia
longipalpis (Diptera, Psychodidae) and to establish an image processing protocol to estimate
the size of the blood meal of sandflies. During the feeding trials, female sandflies aged 3-6 days
after the emergence of adult insects were used. For in vitro feeding, used Hemotek device.
Three membranes were used: i) chick skin membrane (positive control - C+); ii) Parafilm® M
without treatment (negative control - C-); and iii) Parafilm® M treated with Plasma gel (Plasma
gel - PG). In vivo feeding tests were performed with anesthetized hamsters (hamster – H). The
sand flies feeding was evaluated by the percentage of females fed and the blood meal size, using
the dosage of hemoglobin (biochemical test) and/or the abdomen area (image analysis). In the
feeding tests, 1889 females were evaluated, of which 969 were fed (57.03%). The analysis of
all experimental groups (C-, C+, PG, and H) showed that the age of the females influenced the
feeding performance. The longer the post-emergence period, the greater the proportion of
females fed and the smaller the blood meal size. However, the blood meal size was similar
when comparing the results achieved with females of the four ages (3 to 6 days) between the
experimental groups. But the proportion of insects fed was different between them, the order of
the percentage of insects fed obtained was H (83.0%) > C+ (69.1%) >PG (51.4%) > C- (12.9%).
The comparison between hemoglobin dosage and image analysis was based on the results
obtained from the analysis of 1053 females. Among them, the estimative of width (cut = 0.59
mm) and abdominal area (cut = 0.73 mm²) were the ones that presented the best performance
when compared to the hemoglobin dosage, showing convergence in the ability to characterize
the females in fed and unfed of 94.0 and 93.5%, respectively. When the width and the
abdominal area were analyzed as a function of blood variation volume estimated by the
hemoglobin dosage, both showed a high correlation, with R² = 0.84 and 0.85, respectively.
Assunto
Parasitologia, Dípteros, Psychodidae, Leishmaniose, Alimentação Artificial
Palavras-chave
Diptera, Psychodidae, Phlebotominae, Lutzomyia longipalpis, Leishmanioses, Alimentação artificial, Hemotek, Parafilm® M, Plasma gel
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