Avaliação in vitro e in vivo da transição epitélio-mesenquimal e seus efeitos em diferentes modelos de melanoma
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Istéfani Luciene Dayse da Silva
Diego Carlos dos Reis
Karine Araújo Damasceno
Kátia Michelle Freitas
Diego Carlos dos Reis
Karine Araújo Damasceno
Kátia Michelle Freitas
Resumo
O melanoma é a neoplasia maligna originária dos melanócitos, sendo a mais agressiva e com maior taxa de mortalidade dentre as neoplasias cutâneas. A homeostase dos melanócitos é controlada pela interação com os queratinócitos mediada pela expressão de E-caderina. A transição epitélio-mesenquimal (TEM), processo associado a progressão em neoplasias epiteliais, é caracterizada pela mudança de um fenótipo epitelial para mesenquimal, com a redução de expressão de E-caderina e aumento de N-caderina. Nos melanomas a ocorrência e papel da TEM, apesar de observada com algumas similaridades, permanece em discussão devido a origem embriológica não-epitelial dos melanócitos e a alta heterogeneidade histológica e molecular dos melanomas. Os mecanismos de regulação da TEM são amplamente estudados, devido a seu importante papel na progressão neoplásica, tendo sido sugerido que a metformina tem potencial de inibição da sua ocorrência. Assim, neste trabalho investigamos os efeitos da metformina sobre a TEM nas linhagens celulares de melanoma humano A-375 e melanoma murino B16-F10 bem como a relação entre marcadores associados a TEM e a formação de metástases em modelo experimental in vivo de melanoma em camundongos C57BL/6. Para os experimentos in vitro as linhagens foram cultivadas, tratadas com 0mM (controle), 0,5mM ou 5mM de metformina, e avaliada a viabilidade celular, pelo ensaio de MTT, expressão gênica de marcadores da TEM e de diferenciação celular por RT-qPCR, avaliação do potencial invasivo e migratório pelos ensaios de matrigel e cicatrização de feridas. Para avaliação da colonização pulmonar as células B16-F10 cultivadas e tratadas in vitro foram inoculadas via veia caudal em camundongos C57BL/6 que foram acompanhados por 20 dias. Os animais foram eutanasiados e os focos metastáticos no pulmão avaliados, bem como a expressão imuno-histoquímica de E-caderina, N-caderina, ZEB1, ZEB2, Twist, Vimentina, Nanog, Sox10 e CDC47 nas áreas de metástases pulmonares. Nos ensaios in vitro, o tratamento com a metformina não impactou a viabilidade celular em 24 horas de tratamento, porém no tempo de 48 horas o tratamento com 5mM reduziu significativamente o metabolismo celular em ambas as linhagens em relação aos respectivos controles. A expressão gênica de CDH1, CDH2, Snail, ZEB1, ZEB2, OCT3/4, Nanog e miR200-c não apresentou alterações significativas com as concentrações utilizadas em nenhuma das linhagens estudadas, já o potencial migratório de ambas as linhagens foi reduzido frente ao tratamento com as duas concentrações da metformina. No modelo in vivo, observou-se formações metastáticas em apenas 10% (1/10) dos animais que receberam as células tratadas com 5mM de metformina enquanto nos que receberam células sem tratamento prévio ou tratadas apenas com 0,5mM 100% dos animais apresentaram desenvolvimento de metástases pulmonares. Além disso as formações observadas no grupo que recebeu células tratadas com 5mM de metformina eram menores do que as observadas nos outros grupos. Observou-se ainda a redução da expressão proteica de N-caderina, vimentina, CDC47, ZEB2 e Sox10 nas metástases de células previamente tratadas com 5mM. Os resultados indicam que as proteínas envolvidas na TEM, aparentemente, possui papel importante na migração e desenvolvimento de metástases em modelos experimentais de melanoma, evidenciado pela inibição farmacológica com metformina.
Abstract
Melanoma is the malignant neoplasm originating from melanocytes, being the most aggressive and with the highest mortality rate among skin neoplasms. Melanocyte homeostasis is controlled by the interaction with keratinocytes mediated by E-cadherin expression. Epithelial-mesenchymal transition (EMT), a process associated with progression in epithelial neoplasms, is characterized by the change from an epithelial to mesenchymal phenotype, with a reduction in E-cadherin and an increase in N-cadherin expression. In melanomas, the occurrence and role of EMT, although observed with some similarities, remains under discussion due to the non-epithelial embryological origin of melanocytes and the high histological and molecular heterogeneity of melanomas. The regulatory mechanisms of EMT are widely studied, due to its important role in neoplastic progression, and it has been suggested that metformin has the potential to inhibit its occurrence. Thus, in this work we investigated the effects of metformin on EMT in human melanoma A-375 and murine melanoma B16-F10 cell lines as well as the relationship between EMT-associated markers and the formation of metastases in an in vivo experimental model of melanoma in C57BL/6 mice. For the in vitro experiments, the cell lines were cultivated, treated with 0mM (control), 0.5mM or 5mM metformin, and cell viability was evaluated by the MTT assay, gene expression of EMT markers and cell differentiation by RT-qPCR , assessment of invasive and migratory potential by matrigel and wound healing assays. To evaluate lung colonization, B16-F10 cells cultured and treated in vitro were inoculated via the caudal vein into C57BL/6 mice that were followed for 20 days. The animals were euthanized and the metastatic foci in the lung were evaluated, as well as the immunohistochemical expression of E-cadherin, N-cadherin, ZEB1, ZEB2, Twist, Vimentin, Nanog, Sox10 and CDC47 in the areas of lung metastases. In in vitro assays, treatment with metformin did not impact cell viability at 24 hours of treatment, but at 48 hours, treatment with 5mM significantly reduced cell metabolism in both cell lines in relation to the respective controls. The gene expression of CDH1, CDH2, Snail, ZEB1, ZEB2, OCT3/4, Nanog and miR200-c did not show significant changes with the concentrations used in any of the studied cell lines, since the migratory potential of both cell lines was reduced against the treatment with the two concentrations of metformin. In the in vivo model, metastatic formations were observed in only 10% (1/10) of the animals that received cells treated with 5mM of metformin, while in those that received cells without previous treatment or treated with only 0.5mM, 100% of the animals showed development of lung metastases. In addition, the formations observed in the group that received cells treated with 5mM metformin were smaller than those observed in the other groups. A reduction in the protein expression of N-cadherin, vimentin, CDC47, ZEB2 and Sox10 was also observed in the metastases of cells previously treated with 5mM. The results indicate that proteins involved in TEM apparently play an important role in the migration and development of metastases in experimental models of melanoma, as evidenced by pharmacological inhibition with metformin.
Assunto
Fenômenos Fisiológicos Vegetais, Cerrado, Vochysiaceae - Teses, Alumínio, Fotossíntese, Termotolerância, Estresse Oxidativo
Palavras-chave
Experimentação animal, Linhagem celular tumoral, Metástase neoplásica, Metformina, Neoplasias, Animal experimentation, Cell line tumor, Metformin, Neoplasm metastasis, Neoplasms