O uso da ferramenta CRISPR/dCas9 para reprimir e superexpressar progranulina em células humanas
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
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Aristobolo Mendes da Silva
Santuza Maria Ribeiro Teixeira
Santuza Maria Ribeiro Teixeira
Resumo
A esquizofrenia é um transtorno psiquiátrico grave que afeta aproximadamente 23,6 milhões
de pessoas no mundo, com uma prevalência estimada entre 0,3% e 0,7% da população
mundial. Os indivíduos com essa patologia podem apresentar sintomas positivos, como
alucinações e delírios, sintomas negativos, como comportamentos depressivos, pensamento e
fala desordenados e retraimento social, além de déficits cognitivos, como problemas de
atenção e do aprendizado. Além disso, considera-se que a esquizofrenia é um distúrbio
multifatorial. Dessa forma, fatores genéticos e estressores ambientais atuam juntos tornando o
indivíduo mais suscetível a desenvolver a doença. Estudos publicados sugerem que o gene
GRN, que codifica uma glicoproteína conhecida como Progranulina, pode estar associado ao
maior risco de desenvolver esquizofrenia. Dados prévios não publicados do nosso grupo de
pesquisa demonstram que células microglia-like induzidas (iMGs) derivadas de indivíduos
esquizofrênicos expressam níveis menores de Progranulina quando comparados àquelas
derivadas de indivíduos saudáveis. Assim, o objetivo desse trabalho é estabelecer uma
plataforma funcional utilizando o sistema CRISPR/dCas9 para modular a transcrição desse
gene. Para isso, utilizamos os sistemas CRISPRa e CRISPRi através do uso da proteína dCas9
fusionada aos efetores transcricionais VPR e KRAB, respectivamente. Os dados aqui
apresentados demonstram o correto funcionamento do sistema CRISPR/dCas9 tornando
possível a modulação transcricional do gene GRN em células do sistema nervoso central.
Interessantemente, observamos que astrócitos derivados de indivíduos esquizofrênicos, assim
como as iMGs, também apresentam uma desregulação nos níveis de expressão de
Progranulina. Astrócitos derivados de indivíduos esquizofrênicos produziram níveis maiores
do mRNA de Progranulina, quando estimulados com TNF-α, em comparação aos astrócitos
de indivíduos saudáveis. Dessa forma, poderemos utilizar as ferramentas de regulação
transcricional desenvolvidas neste trabalho para modular a expressão da Progranulina em
células derivadas de indivíduos esquizofrênicos visando melhor compreender a importância
dessa proteína na esquizofrenia.
Abstract
Schizophrenia is a severe psychiatric disorder that affects about 23.6 million people
worldwide, with an estimated worldwide prevalence of 0.3% to 0.7%. People with this
pathology may present positive symptoms, such as hallucinations and delusions, negative
symptoms, including depressive behaviors, disordered thinking, and speech and social
withdrawal, as well as cognitive deficits, such as attention and learning problems. In addition,
schizophrenia is considered to be a multifactorial disorder, with genetic factors and
environmental stressors acting together, making individuals prone to develop this disease.
Previous published studies suggest that the GRN gene, which encodes a glycoprotein known
as Progranulin, may be associated with an increased risk of developing schizophrenia.
Previous unpublished data from our research group shows that induced microglia-like cells
(iMGs) derived from individuals with schizophrenia express lower levels of Progranulin
compared to those derived from healthy individuals. Thus, this study aims at establishing a
functional platform using the CRISPR/dCas9 system to modulate the transcription of this
gene. To accomplish that, we employed both CRISPRa and CRISPRi systems, using the
dCas9 protein fused with the transcriptional effectors VPR and KRAB, respectively. The
present data demonstrates the proper functioning of the CRISPR/dCas9 system, making it
possible to transcriptionally modulate the GRN gene in central nervous system cells.
Interestingly, we observed that astrocytes derived from individuals with schizophrenia, as well
as iMGs, also exhibit dysregulation in Progranulin expression levels. Astrocytes derived from
individuals with schizophrenia produced higher levels of Progranulin mRNA when stimulated
with TNF-α compared to astrocytes from healthy individuals. Therefore, we can use the
transcriptional regulation tools developed in this study to modulate Progranulin expression in
cells derived from individuals with schizophrenia, aiming to better understand the importance
of this protein in schizophrenia.
Assunto
Bioquímica e imunologia, Esquizofrenia, Progranulinas, Sistemas CRISPR-Cas
Palavras-chave
Esquizofrenia, Progranulina, CRISPRa, CRISPRi
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