Células tronco mesenquimais autólogas infundidas por perfusão regional venosa na terapia da laminite crônica em equinos
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Vanessa Pinho da Silva
Marília Martins Melo
Leonardo Rodrigues de Lima
Odael Spadeto Júnior
Marília Martins Melo
Leonardo Rodrigues de Lima
Odael Spadeto Júnior
Resumo
A laminite destaca-se dentre as afecções em membros locomotores como principal causa de
afastamento de cavalos de suas atividades. Uma possibilidade terapêutica pouco estudada é
a utilização de células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (adCTM) infundidas
por perfusão regional. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos terapêuticos no uso
de adCTM autólogas infundidas por meio de perfusão regional da veia digital palmar e
compará-los com a infusão de placebo no membro torácico contralateral de equinos em
estágio inicial de laminite crônica. A metodologia experimental foi aprovada pelo Comitê de
Ética (CEUA/UFMG 282/2016). Foram utilizados seis equinos, Mangalarga Marchador,
fêmeas, com peso entre 381± 11 kg, com idade média de 8,3± 4,7 anos, escore corporal 6±1
(escore 1 a 9), atendidos no EV-UFMG, e identificados como portadores de laminite crônica
por meio do histórico, confirmados por exame físico e radiográfico, sendo todos classificados
com grau 1 a 2 de claudicação Obel. O estudo envolveu a avaliação em dois períodos
equivalentes de 30 dias, antes do tratamento e após tratamento. Cada equino recebeu em
ambos os membros torácicos três tratamentos com adCTM [2 x 107 células/ suspendida em
3 ml de PBS e completadas até o volume de 20 ml com solução fisiológica NaCl 0,9% (SF)
– grupo adCTM], ou placebo (SF – grupo placebo) no mesmo volume infundido por perfusão
regional da veia digital lateral por 30 minutos, repetidos a cada 15 dias. Para verificar a
perfusão sanguínea do casco, venografias digitais foram realizadas em ambos os membros
torácicos. Cada projeção foi avaliada para o nível de preenchimento vascular em locais prédeterminados,
pré e pós-tratamento. Como método de avaliação da taxa de crescimento do
estojo córneo, foi utilizado o implante de esferas metálicas na muralha do casco,
acompanhado por exames radiográficos. Para monitoração do crescimento antes da aplicação
de qualquer tratamento, foram realizados dois exames radiográficos com trinta dias de
intervalo (A1 e A30). Para se verificar o efeito pleno das adCTM foram considerados dois
momentos também com trinta dias de intervalo, um quinze dias após a terceira aplicação de
adCTM (D30) e outro trinta dias antes deste momento final (D1). A avaliação da relação
espacial entre falange distal e o estojo córneo foi obtida por programa computacional. As
amostras de biópsia lamelar foram coradas com hematoxilina-eosina e ácido periódico de
Schiff, e foram classificadas quanto ao grau de lesão histológico, histomorfometria epidermal
lamelar e testadas para um protocolo imunohistoquímico para p63 e analisadas por
microscopia pré e pós-tratamento. Considerando a soma dos escores venográficos, houve
uma melhora significativa no grupo adCTM 15 dias após a terceira aplicação quando
comparado ao exame pré-tratamento (P < 0,03). Essa diferença também se manifestou
especificamente nas variáveis perfusão de vasos dorsais lamelares (VDL, P < 0,03) e junção
circunflexa-lamelar (JCL, P< 0,03). O grupo adCTM demonstrou maior distância entre a
borda coronária e o ponto de inserção das esferas ao final dos tratamentos (D30) comparado
ao grupo placebo (P< 0,03). Sobre a relação espacial entre a falange distal e o estojo córneo,
efeitos positivos também foram verificados nos membros tratados com adCTM, promovendo
maio estabilidade da falange distal comparado ao grupo placebo. Os resultados das análises
do grau de lesão histológica global em tecido lamelar pré e pós-tratamento demonstraram
piora no escore global do grupo placebo (P = 0,01), com destaque para perda do eixo
queratinizado (P = 0,0001), hiperplasia do estrato médio (P = 0,001), homogeneidade das
lamelas epidérmicas primárias (P = 0,003) e hiperqueratose (P = 0,05), enquanto o grupo
adCTM não houve piora no escore global, havendo apenas um aumento para hiperplasia do
estrato médio (P = 0,05). Houve diferença entre grupos no escore global pós-tratamento (P
≤ 0,05), com destaque para a variável ausência de eixo queratinizado (P ≤ 0,01). Os achados
deste estudo demonstraram que o protocolo de três aplicações intravenosas de 2 x107 por
perfusão regional no dígito de equinos com laminite crônica estável promove melhorias na
perfusão vascular, na taxa de crescimento do casco, na relação espacial entre casco/falange
distal, no processo cicatricial lamelar apenas no casco tratado com adCTM, não verificando
o mesmo efeito benéfico no grupo placebo.
Abstract
Laminitis stands out among the affections in locomotive limbs as the main cause of the
removal of horses from their activities. A little studied therapeutic possibility are the
mesenchymal stem cells. The objectives of this study were to evaluate blood perfusion, hoof
growth rate and spatial relationship between the hoof capsule and the distal phalanx of horses
with chronic laminitis and who were treated with adCTM infused by regional perfusion in
the digital vein in the thoracic limb comparing with the contralateral limb infused with
placebo solution, describe the histopathological findings of horses with chronic laminitis and
classify the degree of injury pre- and post-treatment with adCTM or placebo; to evaluate
epidermal lamellar histomorphometry before and after treatment with adCTM or placebo; to
test the immunohistochemical protocol for the p63 antibody (progenitor epithelial cells) in
lamellar samples of healthy horses with chronic laminitis. Additionally, a possible systemic
effect of adCTM was observed comparing the results obtained from the infused member with
those of the contralateral limb (placebo). The experimental methodology was approved by
the Ethics Committee (CEUA / UFMG 282/2016). Six equines, Mangalarga Marchador,
females, weighing between 381 ± 11 kg, with mean age of 8.3 ± 4.7 years, body score 6 ± 1
(score 1 to 9), attended at HV-UFMG, and identified as having chronic laminitis through
history, confirmed by physical and radiographic examination, all of them being classified as
grade 1 to 2 of claudication Obel. The study involved the evaluation in two equivalent periods
of 30 days, before treatment and after treatment. Each horse received three treatments with
adCTM [2 x 107 cells / suspended in 3 ml of PBS and completed to the volume of 20 ml with
0.9% NaCl (SF) - adCTM group] or placebo (SF - placebo group) in the same volume infused
by regional perfusion of lateral digital vein for 30 minutes, repeated every 15 days. To verify
the blood perfusion of the hoof, digital venographs were performed on both thoracic limbs.
Each projection was evaluated for the vascular filling level at pre-determined, pre and posttreatment
sites. As a method of evaluating the growth rate of the hoof capsule, the metal
spheres were implanted in the wall of the hoof, accompanied by radiographic examinations.
For growth monitoring before the application of any treatment, two radiographic exams were
performed with a thirty-day interval (A1 and A30). In order to verify the full effect of the
adCTM, two moments were also considered with a thirty-day interval, one fifteen days after
the third application of adCTM (D30) and another thirty days before this final moment (D1).
The evaluation of the spatial relationship between the distal phalanx and the hoof capsule
was obtained by computer program. Samples of lamellar biopsy were stained with
hematoxylin-eosin and periodic acid from Schiff, and were classified according to degree of
histological lesion, epidermal lamellar histomorphometry and tested for an
immunohistochemical protocol for p63 and analyzed by pre and post-treatment microscopy.
Considering the sum of the venography scores, there was a significant improvement in the
adCTM group 15 days after the third application when compared to the pretreatment test (P
<0.03). This difference was also manifested specifically in the variables perfusion of lamellar
dorsal vessels (LDV, P <0.03) and circumflex-lamellar junction (CLJ, P <0.03). The adCTM
group showed a greater distance between the coronary border and the insertion point of the
beads at the end of treatments (D30) compared to the placebo group (P <0.03). On the spatial
relationship between the distal phalanx and the hoof capsule, positive effects were also
observed in the limbs treated with adCTM, promoting stability of the distal phalanx
compared to the placebo group. The results of analyzes of the degree of global histological
lesion in pre and post-treatment lamellar tissue showed a worsening in the overall score of
the placebo group (P = 0.01), with emphasis on keratinized axis loss (P = 0.0001), hyperplasia
(P = 0.001), homogeneity of the primary epidermal lamellae (P = 0.003) and hyperkeratosis
(P = 0.05), while the adCTM group did not present a worsening in the overall score, with
only an increase in mean stratum hyperplasia (P = 0.05). There was a difference between
groups in the global post-treatment score (P ≤ 0.05), especially the absence of keratinized
axis (P ≤ 0.01). The findings of this study demonstrated that the protocol of three intravenous
injections of 2 x107 per regional perfusion in the digit of horses with stable chronic laminitis
promotes improvements in vascular perfusion, hoof growth rate, spatial relation between
hoof capsule / distal phalanx in the process scar tissue only on the hoof treated with adCTM,
not verifying the same beneficial effect in the placebo group.
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Palavras-chave
Equino, Venografia, Terapia celular, Histologia, Laminite
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