DNA Topoisomerase 3α Is Involved in Homologous Recombination Repair and Replication Stress Response in Trypanosoma cruzi
Carregando...
Data
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Artigo de periódico
Título alternativo
A DNA topoisomerase 3α está envolvida no reparo por recombinação homóloga e na resposta ao estresse replicativo em Trypanosoma cruzi
Primeiro orientador
Membros da banca
Resumo
As topoisomerases de DNA são enzimas que modulam a topologia do DNA. Entre elas, a topoisomerase 3α está envolvida na manutenção genômica, atuando na terminação da replicação do DNA, na separação das cromátides irmãs e na dissolução de intermediários de recombinação. Para avaliar o papel dessa enzima em Trypanosoma cruzi , o agente etiológico da doença de Chagas, um parasita com deleção do gene da topoisomerase 3α (TcTopo3α KO) foi gerado, e o crescimento do parasita, bem como sua resposta a diversos agentes que causam danos ao DNA, foram avaliados. Não houve alteração no crescimento causada pela deleção do gene TcTopo3α nas formas epimastigotas, mas observou-se uma maior taxa de dormência. As formas tripomastigotas TcTopo3α KO apresentaram taxas de invasão reduzidas em células LLC-MK2 quando comparadas à linhagem selvagem. A proliferação de amastigotas também foi comprometida no TcTopo3α KO, e um maior número de células dormentes foi observado. Além disso, epimastigotas TcTopo3α KO não foram capazes de recuperar o crescimento celular após exposição à radiação gama, sugerindo o envolvimento da topoisomerase 3α na recombinação homóloga. Esses parasitas também se mostraram sensíveis a drogas que geram estresse replicativo, como cisplatina (Cis), hidroxiureia (HU) e metilmetanossulfonato (MMS). Em resposta aos tratamentos com HU e Cis, os parasitas TcTopo3α KO apresentaram crescimento celular mais lento e não foram capazes de reparar eficientemente os danos ao DNA induzidos por esses agentes genotóxicos. O fenótipo de crescimento celular observado após o tratamento com MMS foi semelhante ao observado após a radiação gama, embora houvesse menos células dormentes após a exposição ao MMS. Os parasitas TcTopo3α KO apresentaram uma população com conteúdo de DNA sub-G1 e forte sinal de γH2A 48 horas após o tratamento com MMS. Portanto, é possível que a proliferação celular com DNA danificado devido à ausência de TcTopo3α leve à morte celular. O sequenciamento do genoma completo de parasitas tratados com MMS mostrou uma redução significativa no conteúdo das famílias multigênicas DFG-1 e RHS, e também uma possível erosão da região subtelomérica do cromossomo 22, em comparação com parasitas knockout não tratados. Experimentos de Southern blot sugerem encurtamento dos telômeros, o que pode indicar instabilidade genômica em células TcTopo3α KO devido ao tratamento com MMS. Assim, a topoisomerase 3α é importante para o reparo por recombinação homóloga e para a resposta ao estresse replicativo em T. cruzi , embora todas as vias nas quais essa enzima participa durante a resposta ao estresse replicativo ainda não estejam totalmente elucidadas.
Abstract
DNA topoisomerases are enzymes that modulate DNA topology. Among them, topoisomerase 3α is engaged in genomic maintenance acting in DNA replication termination, sister chromatid separation, and dissolution of recombination intermediates. To evaluate the role of this enzyme in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, a topoisomerase 3α knockout parasite (TcTopo3α KO) was generated, and the parasite growth, as well as its response to several DNA damage agents, were evaluated. There was no growth alteration caused by the TcTopo3α knockout in epimastigote forms, but a higher dormancy rate was observed. TcTopo3α KO trypomastigote forms displayed reduced invasion rates in LLC-MK2 cells when compared with the wild-type lineage. Amastigote proliferation was also compromised in the TcTopo3α KO, and a higher number of dormant cells was observed. Additionally, TcTopo3α KO epimastigotes were not able to recover cell growth after gamma radiation exposure, suggesting the involvement of topoisomerase 3α in homologous recombination. These parasites were also sensitive to drugs that generate replication stress, such as cisplatin (Cis), hydroxyurea (HU), and methyl methanesulfonate (MMS). In response to HU and Cis treatments, TcTopo3α KO parasites showed a slower cell growth and was not able to efficiently repair the DNA damage induced by these genotoxic agents. The cell growth phenotype observed after MMS treatment was similar to that observed after gamma radiation, although there were fewer dormant cells after MMS exposure. TcTopo3α KO parasites showed a population with sub-G1 DNA content and strong γH2A signal 48 h after MMS treatment. So, it is possible that DNA-damaged cell proliferation due to the absence of TcTopo3α leads to cell death. Whole genome sequencing of MMS-treated parasites showed a significant reduction in the content of the multigene families DFG-1 and RHS, and also a possible erosion of the sub-telomeric region from chromosome 22, relative to non-treated knockout parasites. Southern blot experiments suggest telomere shortening, which could indicate genomic instability in TcTopo3α KO cells owing to MMS treatment. Thus, topoisomerase 3α is important for homologous recombination repair and replication stress in T. cruzi, even though all the pathways in which this enzyme participates during the replication stress response remains elusive.
Assunto
Trypanosoma cruzi, DNA Topoisomerases, Replicação do DNA
Palavras-chave
DNA topoisomerase 3α, Homologous recombination, Replication stress, Trypanosoma cruzi, DNA damage, DNA repair, Dormancy
Citação
Curso
Endereço externo
https://www.frontiersin.org/journals/cell-and-developmental-biology/articles/10.3389/fcell.2021.633195/full