Efeito in vitro e in vivo da adição de cafeína sobre as características do espermatozoide equino pós-descongelamento
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
A criopreservação do sêmen equino é um importante instrumento no melhoramento genético pela maximização do uso de bons reprodutores da espécie. No entanto, este processo reduz a motilidade e longevidade do espermatozoide. Portanto, substâncias ativadoras da motilidade espermática podem ser de suma importância para o sucesso da inseminação artificial com sêmen criopreservado equino. A cafeína é um estimulante da motilidade e capacitação espermática, as quais são características necessárias para a fecundação do oócito. Deste modo, sua adição previa a inseminação artificial com sêmen congelado-descongelado pode ser uma alternativa para aumentar a taxa de fertilidade do sêmen congelado equino. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade espermática in vitro e a fertilidade in vivo do sêmen congelado equino com a adição de diferentes concentrações de cafeína. Para isso, um ejaculado de 9 garanhões foi congelado com diluidor INRA82 e após o descongelamento às amostras foram adicionadas três diferentes concentrações de cafeína perfazendo quatro tratamentos: T1) controle INRA82 (sem adição de cafeína), T2) T1+3mM de cafeína, T3) T1+5mM de cafeína, e T4) T1+7,5mM de cafeína. A motilidade e cinética espermática foram avaliadas com um sistema de análise espermática computadorizada (CASA), a funcionalidade de membrana espermática com um teste hiposmótico e integridade e taxa de reação acrossômica espontânea com citometria de fluxo. As amostras foram avaliadas em quatro tempos: t0) imediatamente após o descongelamento do sêmen, t20) 20 minutos, t30) 30 minutos, t40) 40 minutos e t50) 50 minutos após o descongelamento do sêmen. Após o descongelamento do sêmen, as amostras foram submetidas ao método de seleção espermática swim-up para avaliação do número de espermatozoides recuperados e morfologicamente normais. Estes foram avaliados em quatro tempos: t20) 20 minutos, t40) 40 minutos, t60) 60 minutos e t80) 80 minutos após o swim-up e comparados com o sêmen pós-descongelamento (controle). As concentrações espermáticas de nitrito e peróxido de hidrogênio (µM/µg de proteína) do controle e com 5mM de cafeína foram mensuradas com espectrofotometria. A taxa de fertilidade in vivo foi avaliada por meio de inseminação artificial (IA) de 8 éguas/tratamento, sendo testados o tratamento controle e com 5mM de cafeína. A adição de cafeína não diferiu em relação as taxas de espermatozoides com funcionalidade e integridade de membrana espermática, e taxa de reação acrossômica espontânea entre os grupos (P>0,05). Entretanto, na concentração de 5mM de cafeína houve aumento da motilidade total dos espermatozoides pós-descongelamento (38,9±2,8), diminuição da concentração de nitrito (11,4±2,1), e aumento da taxa de recuperação (7,9x106/ml), e de espermatozoides com morfologia normal (79,9±1,0), após swim-up comparada ao controle (32,6±3,4; 12,8±2,9; 3,4x106/ml±0,7; 70,0±2,0 , respectivamente, P<0,05). A taxa de fertilidade das éguas inseminadas com a adição de 5mM de cafeína foi superior (62,5%) à do grupo controle (12,5%, P<0,05). Em conclusão, a concentração de 5mM de cafeína adicionada ao sêmen equino pós descongelamento exerceu efeito antioxidante e ativador da motilidade espermática equina. Provavelmente, estes foram os responsáveis pelo aumento da taxa de fertilidade das éguas inseminadas com adição de cafeína comparadas ao grupo controle. Portanto, a adição de 5mM de cafeína ao sêmen congelado e descongelado aumentou a taxa de fertilidade equina, podendo ser uma alternativa para o uso na IA de éguas com sêmen de garanhões de baixa qualidade seminal pós-descongelamento.
Abstract
The cryopreservation of equine semen is a crucial tool in genetic improvement by maximizing
the use of sires with high genetic merit. However, the cryopreservation process reduces sperm
motility and longevity. Thus, sperm motility activating substances may play an important role
for the success of equine artificial insemination (AI) with frozen semen. Caffeine is a stimulant
of sperm motility and capacitation, which are important attributes to oocyte fertilization.
Consequently, the addition of caffeine prior to the AI with frozen-thawed semen can be an
alternative to increase the fertility rate of frozen equine semen. The aim of the present work
was to evaluate the in vitro sperm quality and in vivo fertility of frozen-thawed equine semen
after addition of different caffeine concentrations. Thus, one ejaculate of 9 stallions (n=9) was
frozen with INRA82 frozen extender and after thawing three different concentrations of caffeine
were added to the samples performing four treatments: T1) control INRA82 (no caffeine
addition), T2) T1+3mM caffeine, T3) T1+5mM caffeine, and T4) T1+7.5mM caffeine. The
sperm kinetics and motility were evaluated with a computer assisted sperm analysis (CASA),
sperm membrane functionality with a hypoosmotic swelling test, and sperm integrity and
spontaneous acrosome reaction rate with flow cytometry. The samples were evaluated in four
periods: t0) immediately after thawing, t20) 20 min, t30) 30 min, t40) 40 min, and t50) 50 min
after semen thawing. The post-thawed samples were subjected to the swim-up sperm selection
method and the number of recovered and morphologically normal sperm were recorded. Such
samples were evaluated at four period: t20) 20 min, t40) 40 min, t60) 60 min and t80) 80 min
after swim-up and compared to the post-thawing sperm (control). Nitrite and hydrogen peroxide
concentrations (μM / μg protein) from the control and treatment with 5mM caffeine addition
were measured with spectrophotometry. The in vivo fertility rate was assessed with artificial
insemination (AI) of 8 mares/ treatments, control and 5mM caffeine. There was no difference
between the rate of sperm with functional and intact membrane, and spontaneous acrosome
reaction between the control and 5mM caffeine group (P>0,05). However, the concentration of
5mM of caffeine induced an increase of the total sperm motility (38.9±2.8), reduced the nitrite
concentration (11.4±2.1), and also increased the sperm recovery rate (7.9x106/ml) and sperm
with normal morphology (79.9±1.0) after swim-up compared to control (32.6±3.4; 12.8±2.9;
3.4x106/ml±0.7; 70.0±2.0, P<0.05), respectively. Moreover, the AI rate of the 5mM caffeine
group was significantly higher (62.5%) than the control group (12.5%, P<0.05). In conclusion,
5mM of caffeine play a significant role as antioxidant and motility activator of post-thawed
equine sperm. Possibly, these factors were responsible for the higher fertility rate of the
inseminated mares with thawed semen with 5mM caffeine compared to the control. Thus, the
addition of 5mM of caffeine to the frozen-thawed stallion sperm increased the equine fertility
rate, so that it may be an alternative to the use in the mares AI with stallion semen with low
post-thawed quality.
Assunto
Palavras-chave
Equino, Metabolismo, Criopreservação, Sêmen congelado