Avaliação de diferentes protocolos para edição gênica pela metodologia CRISPR/Cas9 em Leishmania amazonensis.
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Silvane Maria Fonseca Murta
Erich Birelli Tahara
Erich Birelli Tahara
Resumo
O sistema CRISPR/Cas9 tem sido considerado uma ferramenta revolucionária para edição gênica em vários organismos. Os knockouts e knock-ins gerados por CRISPR/Cas9 permitem melhor entendimento dos impactos celulares, metabólicos e estruturais causados pela adição ou remoção de algum componente, podendo resultar em avanços no desenvolvimento de vacinas, diagnostico ou intervenções terapêuticas. CRISPR/Cas9 já foi aplicado para diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania, mas não para Leishmania amazonensis, um dos agentes etiológicos mais importantes de leishmaniose tegumentar. No presente trabalho, testamos diferentes protocolos de CRISPR/Cas9 para induzir o knockout no Transportador de Miltefosina (TM) de L. amazonensis como prova de conceito. A expressão da Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) com a transfecção de dois plasmídeos: pLDCN, um vetor epissomal e pRM006, que possui braços de homologia com sequências de UTR de genes de beta-tubulina, promovendo recombinação homóloga e integração no genoma. Uma sequência doadora contendo três códons de terminação in tandem, um sítio de restrição para HindIII e braços de homologia de 30pb foram, também, dados às células transfectadas para guiar o reparo da quebra da dupla fita de DNA por homologia. Alternativamente, expressamos em Escherichia coli a Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9) e confirmamos sua atividade in vitro. Formas promastigotas foram transfectadas com o complexo ribonucleoproteico SaCas9 recombinante e um SgRNA. Foi constatada edição gênica de TM em parasitos transfectados com pLDCN e RNA guia transcrito in vitro, delineado para essa espécie, apesar das limitações associadas ao genoma de L. amazonensis disponível, assim como para SaCas9 recombinante. Parasitos transfectados com pRM006 perderam a resistência à higromicina e não foram editados. A cepa gerada com SaCas9 recombinante se mostrou aproximadamente 6 vezes mais resistente que os parasitos selvagens à miltefosina. Avaliamos ainda a infectividade de parasitos mutantes para macrófagos da medula óssea de camundongos. No entanto, não foi observada diferença significativa nas taxas de infecção, quando comparados aos parasitas wild type. Em conjunto, nossos resultados demonstraram a possibilidade de edição do genoma de L. amazonensis por diferentes protocolos de CRISPR/Cas9, que podem ainda ser otimizados. Os parasitos resistentes a miltefosina podem agora ser melhor caracterizados em relação a alterações fenotípicas decorrentes da edição do gene TM.
Abstract
The CRISPR/Cas9 system has been considered as a revolutionary tool to promote gene
edition in a wide array of organisms. The knockouts and knock-ins generated by CRISPR/Cas9
allow better understanding of cellular, metabolic or structural impacts caused by addition or
removal of some component, which may result in advances related to vaccine development,
diagnostic or therapeutic interventions. CRISPR/Cas9 has already been applied in different
studies for different Leishmania species, but not to Leishmania amazonensis, one of the most
important etiologic agents of tegumentary leishmaniasis. In the present work, we tested
different CRISPR/Cas9 protocols to introduce knockout on L. amazonensis Miltefosine
Transporter (MT) as a proof of concept. The expression of Streptococcus pyogenes Cas9
(SpCas9) was obtained by transfection with two plasmids: pLDCN, which is an epissomal
vector and pRM006, which contains homology arms with beta-tubulin UTR sequences,
promoting homologous recombination, and integration to the genome. A Donor sequence
containing three stop codons in tandem as well as a restriction site for HindIII and 30bp
homology arms was also given to the transfected cells to guide the double strand break repair
though homology. Alternatively, we expressed Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) on
Escherichia coli and assorted its activity in vitro. Promastigotes were transfected with a
ribonucleoprotein complex of the recombinant SaCas9 and a SgRNA. MT edition was
confirmed on parasites transfected with pLDCN and an in vitro transcribed SgRNA, designed
to this species, despite the limitations associated with the current L. amazonensis genome
sequence available, and as well as with recombinant SaCas9. Parasites previously transfected
with pRM006 lost their resistance to higromicine and weren’t edited. The cell line generated
using recombinant SaCas9 showed to be approximately 6 times more resistant to miltefosine
than its wild type counterpart. We evaluated the infectivity of this mutant cell line to bone
marrow derivated macrophages. However, no significant difference was observed when
comparing it to wild types. Together, our results showed the possibility of genome editing in L.
amazonensis with different protocols of CRISPR/Cas9, which may still be optimized. The
miltefosine resistant parasites may now be better characterized regarding the phenotypic
changes related to the MT gene edition.
Assunto
Palavras-chave
CRISPR/Cas9, Leishmania, Leishmania amazonensis, knockout gênico, transportador de miltefosina