Desenvolvimento e padronização de metodologias visando a prospecção e caracterização de novos vírus associados a microalgas e cianobactérias
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
Vírus grandes nucleocitoplasmáticos de DNA (filo Nucleocytoviricota) são vírus que possuem
características ímpares e que desafiam a própria definição de vírus. Fazem parte desse filo os chlorovírus,
que são vírus com grandes partículas e genomas complexos que infectam microalgas do tipo clorela. Seu
genoma viral contém diversos genes que codificam tRNAs e proteínas, incluindo enzimas envolvidas no
metabolismo energético e na síntese de macromoléculas, além de centenas de regiões codificadoras (CDS)
nunca antes identificadas em outros organismos. Assim, o isolamento e a caracterização de novos
chlorovírus, apresentam grande potencial para a descoberta e caracterização de novas proteínas. Apesar de
já terem sido identificados em diversas localidades e o Brasil ser um hotspot de biodiversidade, estes vírus
não são explorados por aqui. O mesmo ocorre com os cianófagos, que são vírus que infectam
cianobactérias e são importantes reguladores da sua abundância e composição. Como a descoberta e
caracterização destes vírus supracitados é tão importante, faz-se também, imprescindível o
desenvolvimento, adaptação e padronização de técnicas que permitam o isolamento e a caracterização de
vírus de algas e cianobactérias. Neste trabalho serão abordados os vírus que infectam cianobactérias do
gênero Microcystis, amplamente distribuídas pelo mundo e que causam eflorescências algais, um fenômeno
comum caracterizado pela proliferação celular exacerbada. Paradoxalmente, a essa distribuição, vírus que
infectam essas cianobactérias só foram isolados em alguns países do oriente até então. Explorar novos
ambientes em busca de cianófagos pode auxiliar na compreensão deste grupo tão diverso e novos isolados
podem ajudar na resolução das lacunas relacionadas à filogenia e biologia destes vírus. Sendo assim o
objetivo geral deste trabalho foi definir, testar e padronizar métodos visando o isolamento e a
caracterização de novos vírus associados a cianobactérias e microalgas. Para tal, foram feitas curvas de
crescimento das algas e cianobactérias, testes de manutenção das células em diferentes meios de cultura,
padronização de ensaios de placa, de ensaios de prospecção e de diferentes métodos de titulação, além da
caracterização dos efeitos citopáticos por microscopia óptica e eletrônica. Adicionalmente, foram feitas
análises genômicas e filogenéticas in silico de fagos que infectam Microcystis. Para duas das amostras
ambientais testadas foi possível observar alterações celulares indicativas de efeito citopático, sendo uma em
Chlorella vulgaris (incluindo a formação de placas de lise celular em ensaio de placa) e outra em
Microcystis aeruginosa. Foram estabelecidos protocolos para a realização de prospecções, cultivo,
subcultivo e manutenção das células e também preparo de amostras para Microscopia Eletrônica de
Transmissão que fornece imagens com alta resolução e pode ser usado para todas as células testadas. As
análises in silico por sua vez, revelaram que o grupo dos cianófagos que infectam Microcystis é parafilético
e seus genomas variam substancialmente, não existindo blocos sintênicos conservados entre todos os
cianófagos, nem COGS compartilhadas por todos. Os resultados deste trabalho sugerem que o uso desses
métodos modificados pode fornecer condições para o isolamento dos primeiros vírus que infectam algas do
gênero Chlorella e cianófagos brasileiros.
Abstract
Large nucleocytoplasmic DNA viruses (phylum Nucleocytoviricota) are viruses with unique characteristics
that defy the very definition of a virus. This phylum includes chloroviruses, which are viruses with large
particles and complex genomes that infect chlorella-like microalgae. Their viral genome contains several
genes that encode tRNAs and proteins, including enzymes involved in energy metabolism and the synthesis
of macromolecules, as well as hundreds of coding regions (CDS) never before identified in other
organisms. Thus, the isolation and characterization of new chloroviruses has great potential for the
discovery and characterization of new proteins. Although these viruses have already been identified in
various locations and Brazil is a biodiversity hotspot, they have not been explored here. The same occurs
with cyanophages, which are viruses that infect cyanobacteria and are important regulators of their
abundance and composition. As the discovery and characterization of these aforementioned viruses is so
important, it is also essential to develop, adapt and standardize techniques that enable the isolation and
characterization of viruses from algae and cyanobacteria. In this work we focused on viruses that infect
cyanobacteria of the genus Microcystis, which are widely distributed throughout the world and cause algal
blooms, a common phenomenon characterized by exacerbated cell proliferation. Paradoxically, viruses
infecting these cyanobacteria have only been isolated in a few eastern countries. Exploring new
environments in search of cyanophages can help to understand this diverse group and new isolates can help
to solve the gaps related to the phylogeny and biology of these viruses. The objective of this work was to
define, test and standardize methods for isolating and characterizing new viruses associated with
cyanobacteria and microalgae. To achieve that, algae and cyanobacteria growth curves, cell maintenance
tests in different culture media, standardization of plaque assays, prospecting assays and different titration
methods were carried out, as well as characterization of cytopathic effects by optical and electron
microscopy. In addition, in sílico genomic and phylogenetic analyses of phages that infect Microcystis were
carried out. For two of the several environmental samples tested, it was possible to observe cellular
alterations indicative of a cytopathic effect, one in Chlorella vulgaris (including the formation of cell lysis
plaques in a plaque assay) and the other in Microcystis aeruginosa. Protocols were established for
prospecting, cultivating, subculturing and maintaining the cells, as well as preparing samples for
Transmission Electron Microscopy, which provides high-resolution images and can be used for all the cells
tested. In sílico analysis revealed that the group of cyanophages that infect Microcystis is paraphyletic and
their genomes vary substantially, with no syntenic blocks conserved between all cyanophages, nor COGS
shared by all. The results of this work suggest that the use of these modified methods may provide
conditions for the isolation of the first brazilian viruses infecting algae of the genus Chlorella and
cyanophages.
Assunto
Microbiologia, Chlorella, Clorófitas, Cianobactérias, Vírus
Palavras-chave
Prospecção viral, Chlorovírus, Metodologias, Caracterização de vírus ambientais, Cianobactérias, Clorelas, Cianófagos, Algas verdes