Desenvolvimento e avaliação de vacina contra tripanossomatídeos composta por sequências peptídicas selecionadas por phage display
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
As leishmanioses e a doença de Chagas estão entre as doenças tropicais negligenciadas de maior importância no mundo, afetando milhões de pessoas. Embora o controle através da vacinação seja promissor, nenhuma vacina eficaz está disponível. Neste trabalho, a seleção de candidatos vacinais foi realizada através da técnica de phage display. Esta técnica consiste na fusão de peptídeos à superfície do capsídeo de bacteriófagos, produzindo bibliotecas capazes de exibir um amplo repertório de epitopos lineares e conformacionais aleatórios, que podem ser selecionados através da sua afinidade a diversos tipos de ligantes, como anticorpos. Assim, três infecções foram realizadas em camundongos BALB/c utilizando uma cepa de Leishmania donovani geneticamente deficiente para o gene da centrina (LdCEN-/-), enquanto camundongos da linhagem C57BL/6 foram infectados duas vezes com a cepa Y de Trypanosoma cruzi. O soro coletado foi avaliado em relação ao aumento da reatividade de anticorpos através do ensaio de ELISA, e as imunoglobulinas de classe G anti-LdCEN-/- e anti-T. cruzi foram precipitadas e purificadas. Para identificação de peptídeos capazes de se ligarem especificamente aos anticorpos foram realizados ciclos de seleção utilizando bibliotecas de peptídeos de 12, 15 e 17 aminoácidos. Os clones dos fagos mais reativos tiveram seu DNA sequenciado e traduzido em aminoácidos. Estes peptídeos foram sintetizados em membrana de celulose através da técnica de “SPOT Synthesis” e de forma solúvel, a fim de investigar sua reatividade contra o soro de animais infectados por Leishmania spp. e T. cruzi. Clones de fagos expressando os peptídeos selecionados foram utilizados para imunizar camundongos BALB/c, que tiveram o perfil de resposta imune celular gerado pós vacinação avaliado através de citometria de fluxo. Após infecção desafio por L. infantum, L. amazonensis e T. cruzi, a carga parasitária foi quantificada e possíveis alterações histopatológicas foram avaliadas. O sequenciamento identificou dez peptídeos diferentes, dos quais sete foram selecionados pela IgG anti-LdCEN-/- e três pela IgG anti-T. cruzi. Todos os peptídeos sintetizados em membrana e de forma solúvel foram reconhecidos por pelo menos um pool de soro avaliado, demonstrando seu potencial como componente vacinal. O esquema de imunização induziu produção crescente e específica de anticorpos, além de estimular um perfil de memória celular, aumento de IFN-ɣ e redução de IL-10. Foi observada redução de carga parasitária nos animais desafiados por L. infantum, L. amazonensis e T. cruzi, aliada à maior preservação morfológica de todos os órgãos analisados. Como perspectiva, as sequências peptídicas selecionadas serão inseridas no genoma da cepa de Leishmania major geneticamente deficiente e reconhecidamente protetora (LmCEN-/-). A validação do uso de uma vacina viva como carreadora de sequências peptídicas imunogênicas poderá permitir, em seguida, a inserção de outros genes de interesse. Isto pode levar ao desenvolvimento de uma vacina multicompetente eficaz não só contra as leishmanioses e a doença de Chagas, como também diversas outras doenças, parasitárias e não parasitárias.
Abstract
Leishmaniasis and Chagas disease are among the most important neglected tropical
diseases in the world, affecting millions of people. Although control through vaccination
is promising, no effective vaccine is available. In this work, the selection of vaccine
candidates was performed using the phage display technique. This technique consists
on fusing peptides to the surface of a bacteriophage capsid, producing libraries able
to display a wide repertoire of linear and conformational random epitopes, which can
be selected through their affinity to different types of ligands, such as antibodies. Thus,
three infections were performed in BALB/c mice using a strain of Leishmania donovani
genetically deficient for the centrin gene (LdCEN-/-), while C57BL/6 mice were infected
twice with the Y strain of Trypanosoma cruzi. Increase in antibody reactivity was
evaluated through ELISA assay, and anti-LdCEN-/- and anti-T. cruzi class G
immunoglobulins were precipitated and purified. To identify specifically binding
peptides, selection cycles were performed using peptide libraries with 12, 15 and 17
amino acids. The most reactive phage clones had their DNA sequenced and translated
into amino acids. These peptides were synthesized in cellulose membrane using the
"SPOT Synthesis" technique and also in a soluble form, in order to investigate their
reactivity against Leishmania spp. and T. cruzi sera. Phage clones expressing the
selected peptides were used to immunize BALB/c mice, which had their post-
vaccination cellular immune response profile evaluated by flow cytometry. After
challenge infection by L. infantum, L. amazonensis and T. cruzi, parasite load was
quantified and possible histopathological changes were evaluated. Sequencing
identified ten different peptides, of which seven were selected by anti-LdCEN-/- IgG
and three by anti-T. cruzi IgG. All peptides synthesized both in membrane and in
soluble form were recognized by at least one sera pool evaluated, demonstrating its
potential as a vaccine component. The immunization scheme induced increasing and
specific antibody production, in addition to stimulating a cellular memory profile, IFN-ɣ
increase and IL-10 reduction. A reduction in parasite load was observed in mice
challenged by L. infantum, L. amazonensis and T. cruzi, combined with greater
morphological preservation of all analyzed organs. As future perspective, the selected
peptide sequences will be inserted into the genome of a genetically deficient and
protective Leishmania major strain (LmCEN-/-). Validating the use of a live vaccine as
an immunogenic peptide carrier could then allow the insertion of other genes of
interest. This could lead to the development of an effective multicompetent vaccine not
only against leishmaniasis and Chagas disease, but also several other pathologies,
both parasitic and non-parasitic.
Assunto
Parasitologia, Leishmaniose, Doença de Chagas, Vacinas
Palavras-chave
Leishmanioses, Doença de Chagas, Vacina, Phage display