The role of nutrients (phosphorus and nitrogen) In modulating saxitoxin gene expression in Raphidiopsis raciborskii (Cyanobacteria): laboratory experiments and field observations

Abstract

O desenvolvimento de florações de cianobactérias em sistemas aquáticos é principalmente causado pela disponibilidade de nutrientes, especialmente nitrogênio e fósforo. Quando as florações são dominadas por espécies potencialmente tóxicas, os efeitos nocivos da carga de nutrientes tornamse particularmente relevantes. Algumas das cianotoxinas recorrentes com maior potencial em corpos d'água são as saxitoxinas. As saxitoxinas (STXs) são alcalóides neurotóxicos produzidos por dinoflagelados marinhos e algumas espécies de cianobactérias filamentosas de água doce. Entre as espécies tóxicas de cianobactérias, Raphidiopsis (anteriormente Cylindrospermopsis) raciborskii é uma espécie amplamente distribuída e cada vez mais registrada em sistemas de água doce em todo o mundo. É particularmente preocupante porque as cepas em algumas áreas geográficas são capazes de produzir toxinas com implicações para a saúde humana e animal. Os estudos desta espécie aumentaram rapidamente nas últimas duas décadas, especialmente no hemisfério sul, onde as cepas tóxicas são predominantes. Esta espécie apresenta uma grande flexibilidade mesmo sob condições de nutrientes baixos e variáveis, ajudada pela sua considerável tolerância fisiológica. Existem dois tipos de toxinas produzidas por R. raciborskii: cilindrospermopsinas (CYNs) e saxitoxinas (STXs). Cepas de R. raciborskii encontradas em ecossistemas sul-americanos são caracterizadas pela produção de saxitoxina e seus análogos (Paralytic Shellfish Poisoning, PSP), e os fatores que desencadeiam sua produção não foram ainda elucidados. Neste estudo, foi examinado o efeito do estresse de nitrogênio (N) e fósforo (P) na saxitoxina e seus análogos produzidos em R. raciborskii. O objetivo deste estudo foi dividido em duas categorias: 1) O efeito da disponibilidade de nitrogênio e fósforo na expressão gênica da saxitoxina e na produção intracelular das toxinas em R. raciborskii, realizado em experimentos de laboratório (in vitro). 2) A estimativa da expressão gênica da saxitoxina em R. raciborskii e sua relação com a disponibilidade de fósforo e nitrogênio no reservatório da Pampulha (Brasil), realizada em experimentos ambientais, de campo (in situ). Em experimentos de laboratório (in vitro), a PCR quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR) foi utilizada para investigar a resposta transcricional do gene sxtA4 à limitação de nitrogênio e fósforo em duas cepas tóxicas de R. raciborskii. Os resultados mostraram que o gene sxtA4 foi em

geral regulado positivamente quando as cepas cresciam sob menor concentração de nutrientes. Correlações foram observadas entre transcritos dos genes sxtA4 (gene sxt), ntcA (regulador global de nitrogênio) e nifH (fixação de N2) em condições N-limitadas. Além disso, foi identificada uma correlação significativa entre os genes sxtA4 e pstS (gene que codifica a proteína periplasmática de ligação ao fosfato) em condições limitadas por P. A concentração de toxina foi medida por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Sob limitação de N, a concentração total de saxitoxina intracelular foi mais alta com concentração de 10% de N em ambas as cepas; quase similar às alterações na expressão do gene sxtA4, que na cepa 186 foi maior com limitação de 10%, enquanto na cepa 36 com limitação de N de 1%. No entanto, a quantidade de toxinas intracelulares totais diminuiu significativamente sob limitação de P em ambas as cepas, o que foi contrário à transcrição do gene sxtA4 que mostrou aumento significativo sob limitação de P em comparação ao controle (P mais elevado) em ambas as cepas. Este estudo mostrou que a limitação de nutrientes tem efeito na produção total de toxinas intracelulares, mas embora a limitação de ambos os nutrientes induza maior expressão gênica, a redução de N pode levar a uma maior produção de toxinas intracelulares, enquanto a redução de fósforo pode resultar em redução de toxinas. Estes são aspectos importantes a serem considerados quando se trata do manejo de corpos d'água dominados por cianobactérias. Em experimentos ambientais de campo (in situ), os resultados mostraram que as limitações de P e N estavam significativamente relacionadas à abundância de transcritos dos genes ntcA e pstS, como esperado, mas também de sxtA4. A expressão desses genes aumentou significativamente com a diminuição das concentrações de N e P. Além disso, foi observada uma correlação significativa entre a biomassa de R. raciborskii e a expressão do gene sxtA4. Este estudo mostrou que em um reservatório hipereutrófico com florescimentos persistentes de cianobactérias, mudanças sazonais na concentração de P e N podem ser consideradas fatores críticos não apenas para o desenvolvimento do florescimento de cianobactérias, mas também para a regulação de sua toxicidade. Concluindo, no presente estudo, por meio de experimentos de laboratório e medições de campo, encontramos que a limitação de nutrientes foi um importante estressor na regulação e produção de toxinas em R. raciborskii. Estudos de laboratório e de campo são ferramentas importantes para compreender o papel dos fatores ambientais sobre essas toxinas, bem como o impacto potencial

das toxinas no meio ambiente. Os resultados obtidos neste trabalho também fornecem alguns insights sobre a presença do gene sxt e de toxinas intracelulares em cepas de R. raciborskii.