Avaliação de matriz óssea humana mineralizada e desmineralizada como Scaffold para bioengenharia tecidual óssea
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
A busca por soluções para perdas ou lesões do tecido ósseo tem estimulado pesquisas que
visam a melhoria, a evolução e o desenvolvimento de novos biomateriais de enxertia
óssea. Atualmente, enxertos alógenos representam uma alternativa importante, já
utilizada em procedimentos clínicos em ortopedia e odontologia. O osso alógeno tem sido
indicado como biomaterial de preenchimento, com finalidade osteocondutora e
osteoindutora. Mas o potencial de uso da matriz orgânica desmineralizada tem sido pouco
estudado. As pesquisas em bioengenharia tecidual óssea tem avançado no intuito de
associar tipos celulares diferentes à matrizes 3D modificadas. Neste estudo foram
avaliados os potenciais de matrizes ósseas humanas mineralizadas (OHM) e
desmineralizadas (OHD) para induzirem a proliferação e diferenciação de células tronco
mesenquimais de polpas dentárias (CTPD) e de linhagens osteoblásticas primárias (OP)
e imortalizadas (OI) em culturas 3D. As CTPD foram coletadas de incisivos de ratos
machos wistar adultos; os OP coletados de calvária de neonatos de ratos com 3 dias de
vida; e os OI adquirido comercialmente. Fragmentos ósseos foram obtidos junto ao Banco
de Tecido Músculo Esquelético da Universidade de Marilia – SP (UNIOSS). A versão
desmineralizada foi obtida em laboratório, utilizando solução quelante de EDTA 10%.
As CTPD apresentaram características imunofenotípicas e capacidade de diferenciação
similar às células tronco mesenquimais. Os OP e OI foram confirmados pela expressão
de Osteopontina, BMP4, Colágeno tipo 1 e RUNX2; além de mineralizarem após 21 dias
em meio osteogênico. Na caracterização das matrizes, o OHM apresentou-se opaco e com
55% dos seus poros > 500 µm; enquanto que o OHD apresentou-se translúcido, com 76%
dos poros > 500 µm. O processo de desmineralização preservou os componentes da matriz
orgânica, avaliados por imufluorescência de proteínas ósseas. Os índices de viabilidade
dos OP e OI foram maiores quando cultivados sobre os scafflds OHD, quando comparado
aos índices obtidos com OHM. As CTPD, no entanto, apresentaram resultado oposto:
foram mais viáveis quando cultivadas sobre scaffolds de OHM. Os resultados de MEV
revelaram que todos os tipos celulares aderiram e formaram uma camada contínua sobre
ambos scaffolds. O OHD foi ainda capaz de induzir maior atividade da enzima fosfatase
alcalina e nódulos de mineralização maiores em todos os tipos celulares, comparados aos
dados obtidos com OHM. Os resultados obtidos indicaram, portanto, um importante
potencial da matriz óssea humana desmineralizada como scaffold e utilização das CTPD
para a bioengenharia tecidual óssea.
Abstract
The search for solutions for the bone loss or lesions has been stimulating researches to
improve or develop new biomaterials to be used as bone grafts. Currently, allogeneic
grafts represent an important alternative and have been widely used in orthopedic and
odontologic clinics. Allogene bone has been utilized as biomaterial to fill the lesion site,
promoting osteoconduction and osteoinduction. However, the potential of the use of the
organic demineralized matrix has not been fully investigated thus far. Bone tissue
bioengenering research has improved with the association of different cell types with
modified 3D matrix. In this work, the potential of human bone matrix in mineralized
(MHB) and demineralized (DHB) forms to induce dental pulp stem cell (DPSC) and
osteogenic cell line (primary - PO; and immortalized - IO osteoblasts) proliferation and
differentiation were evaluated in 3D culture. DPSC were isolated from Wistar rat incisive
teeth; PO from 3 day-old rat calvariae; and the IO were commercialy obtained. Bone
fragments were obtained from the Musculoskeletics Tissue Bank, at the University of
Marília (SP, UNIOSS). The demineralized form of the bone graft was obtained in the lab
using 10% EDTA as quelant solution. DPSC showed immunophenotipic and
differentiation capacity characteristics similar to mesenchymal stem cells. PO and IO
were confirmed by the expression of Osteopontin, BMP4, Type I Collagen and Runx2
and by their mineralization capacity after 21 days of culture in osteogenic media. In the
characterization of the bone grafts, the MHB showed an opaque structure, with 55% of
their pores > 500 μm while the DHB was found to be translucid, showing 76% of their
pores > 500 μm. The demineralization process preserved the components of the organic
matrix, as revealed by positive immunofluorescence for bone markers. PO and IO showed
higher viability indexes when cultivated onto scaffolds of DHB compared to the data
obtained with MHB. DPSC, however, showed the opposite result: viabilty indexes of
these cells were higher when they were cultivated onto MHB as scaffolds. Scanning
eletronic microscopy (SEM) revealed that all cell types could adhere and form a
continuous layer on both scaffolds. The DHB was also able to induce higher alkaline
fosfatase activity and larger mineralization nodules in all cell types (DPSC, PO and IO),
compared to the data obtained with MHB. Therefore, these results showed an important
potential of demineralized human bone matrix as a scaffold in bone tissue bioengenering.
Assunto
Biologia Celular, Bioengenharia, Células-Tronco, Matriz Óssea
Palavras-chave
Banco de osso humano, Bioengenharia tecidual óssea, Células-tronco da polpa dentária, Scaffods, Matriz óssea desmineralizada, Matriz óssea mineralizada
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