Microcalorimetric Study of Acetylcholine and Acetylthiocholine Hydrolysis by Acetylcholinesterase
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Estudo microcalorimétrico da hidrólise da acetilcolina e da acetiltiocolina pela acetilcolinesterase
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Resumo
A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima importante responsável pela clivagem da acetilcolina. Estudos da atividade dessa enzima utilizam um substrato artificial, a acetiltiocolina, porque um produto de sua catálise, a tiocolina, gera facilmente um composto que absorve luz ao reagir com o reagente de Elman, o ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB). A hidrólise da acetilcolina não pode ser analisada por esse método. A calorimetria de titulação isotérmica permite analisar a hidrólise de ambos os substratos, sem a necessidade de reagentes adicionais além da enzima e do substrato. Para comparar os valores cinéticos obtidos na hidrólise da acetilcolina (ACh) e da acetiltiocolina (ATCh), com o carbaril atuando como inibidor, utilizou-se uma técnica calorimétrica para avaliar as propriedades cinéticas das duas reações. Esse método permite visualizar a hidrólise de ambos os substratos pela troca de calor que ocorre durante a catálise. Além disso, possibilitou avaliar a inibição da AChE pelo carbaril, um inseticida comum. Os resultados mostram similaridade entre os valores obtidos com ambos os substratos. substratos, que são ligeiramente maiores para a acetilcolina, o substrato natural da enzima. Os valores dos parâmetros enzimáticos de ATCh e ACh foram semelhantes entre si e as constantes de inibição usando carbaril também foram semelhantes, demonstrando que qualquer abordagem à ACh é viável usando ATCh. Os resultados obtidos por ITC mostram a precisão alcançada pelo método calorimétrico.
Abstract
Acetylcholinesterase (AChE) is an important enzyme responsible for the cleavage of acetylcholine. Studies of the activity of this enzyme use an artificial substrate, acetylthiocholine, because a product of its catalysis, thiocholine, readily generates a light absorbing product upon reaction with Elman’s reagent 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid (DTNB). The hydrolysis of acetylcholine cannot be assayed with this method. The isothermal titration calorimetry can assay the hydrolysis of both substrates, without requiring additional reagents other than the enzyme and the substrate. To compare kinetic values obtained in the hydrolysis of acetylcholine (ACh) and acetylthiocholine (ATCh), with carbaryl acting as inhibitor, a calorimetric technique was used to evaluate kinetic properties of the two reactions. This method can show the hydrolysis of both substrates by the heat exchange that occurs during catalysis. In addition, it allowed the assessment of the AChE inhibition by carbaryl, a common insecticide. The results show a similarity between values obtained with both substrates, which are slightly higher for acetylcholine, the enzyme natural substrate. Enzymatic parameters values from ATCh and ACh were similar to each other and inhibitory constants using carbaryl were also similar, displaying that any approach to ACh is feasible using ATCh. The results obtained from ITC show the precision achieved by the calorimetric method.
Assunto
Acetilcolinesterase, Enzimas, Acetiltiocolina, Acetilcolina, Carbaril
Palavras-chave
Acetylcholinesterase, Acetylcholine, Acetylthiocholine, Isothermal Titration Calorimetry, Carbaryl
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