Desenvolvimento de matriz 3D a base de quitosana, gelatina e condroitina como suporte para osteogênese de células-tronco derivadas do tecido adiposo e sua aplicação em Engenharia de Tecido ósseo
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Resumo
A reconstrução de grandes segmentos ósseos continua a ser um problema clínico importante. Os impactos clínicos e econômicos de tratamentos de defeito ósseo são surpreendentes. As abordagens terapêuticas atuais incluem transplante de enxertos ou implantes de diferentes biomateriais sintéticos, mas nenhum deles revelou-se plenamente satisfatória. A Engenharia de Tecidos fornece uma alternativa promissora para a reparação de lesões no tecido ósseo provocada por traumas ou associadas ao envelhecimento, como a osteoporose. A proposta desta nova área da medicina regenerativa consiste em combinar células, matriz suporte e agentes bioativos para a regeneração de um novo tecido funcional. As estruturas porosas 3D são usadas como modelos para a semeadura celular temporária, migração, proliferação e diferenciação antes da regeneração do tecido biologicamente funcional ou da matriz extracelular natural. No campo da ortopedia, o uso de implantes bioabsorvíveis está se tornando mais frequente. Essas matrizes devem ser porosas, se assemelhar à MEC do tecido nativo, além de serem biocompatíveis e biodegradáveis. A quitosana, em associação à gelatina e condrotina, atende às necessidades básicas para a escolha do polímero constituinte da matriz. A decisão do tipo celular é particularmente importante no desenvolvimento da Engenharia de Tecidos. Células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) surgem como candidata ideal a essa técnica, uma vez que apresenta potencial de autorenovação e multilinhagem. Partindo desse princípio, o presente trabalho visou desenvolver e caracterizar matrizes 3D de quitosana, gelatina e condroitina e avaliar resposta in vitro e in vivo de osteogênese de ADSC nesses biomateriais. A matriz 3D neste estudo se apresentou altamente porosa, possuindo poros interconectados. Quando induzidas à osteogênese, tanto em cultivo 2D quando 3D, as ADSC passaram a expressar marcadores específicos de células osteogênicas. Em cultivo em matriz 3D, ADSC foram capazes de aderência e interconectividade celular, além de terem sua proliferação, viabilidade e osteogênese aumentadas, como demonstram os resultados dos ensaios de MTT, FA, dosagem de colágeno e colorações de estruturas mineralizadas. Através de análises dos implantes em sítio ectópico e em lesões de calvária de ratos in vivo foi possível demonstrar que a matriz 3D não induziu uma resposta inflamatória intensa e não afetou a função dos tecidos adjacentes ao implante. A matriz se mostrou biocompatível e biodegradável, além de permitir a angiogênese do implante. Quando colonizadas por ADSC, os implantes apresentaram uma angiogênse precoce, e uma osteogênese mais madura. Além disso, ADSC-EGFP foram visualizadas inseridas na MEC neoformada. Assim, matrizes 3D desenvolvidas no presente estudo se mostraram promissoras para engenharia de tecidos ósseo, sendo biocompatíveis, biodegradáveis e provendo um bom ambiente para a adesão e proliferação, angiogênese e osteogênese celular. A união dos dados obtidos por este trabalho nos permite vislumbrar a possibilidade de utilização da matriz 3D de quitosana, gelatina e condoitina como um potencial carreador para células-tronco mesenquimais na Engenharia de Tecido ósseo. Assim, nosso estudo abre uma perspectiva para sua aplicação clínica e para futuros estudos destinados à reconstrução tecidual
Abstract
The reconstruction of major bone segments remains a significant clinical problem. The
clinical and economic impacts of the bone defect treatments are amazing. The currently
available therapeutic approaches include transplant grafts or different synthetic
biomaterials implants, but none has proved to be entirely satisfactory. Tissue
Engineering provides a promising alternative for the repair of lesions in the bone tissue
caused by trauma or associated with aging such as osteoporosis. The purpose of this
new field of regenerative medicine is to combine cell, scaffold and bioactive agents for
the regeneration of a new functional tissue. The 3D porous structures are used as models
for the temporary cell seeding, migration, proliferation and differentiation of the tissue
prior to regeneration or biologically functional natural extracellular matrix. In the field
of orthopedics, the use of bioabsorbable implants is becoming more common. These
arrays must be porous extracellular matrix (ECM), resemble the native tissue, and be
biocompatible and biodegradable. Chitosan, in combination with gelatin and
chondroitin, meets the basic needs for the choice of the constituent polymer matrix. The
decision of the cell type is particularly important in the development of tissue
engineering. Stem cells derived from adipose tissue (ADSC) appear to be an ideal
candidate for this technique, since it presents the potential for self and multilinhage.
Based on this principle, this study aimed to develop and characterize 3D matrices of
chitosan, gelatin and chondroitin, and assessing response in vitro and in vivo of ADSC
osteogenesis in these scaffolds. The 3D matrix of this study was highly porous, having
interconnected pores. When osteogenesis is induced, in 2D and 3D culture, the ADSC
began to express specific markers of osteogenic cells. In cultivation in 3D matrix,
ADSC were capable of cell adhesion and interconnectivity, as well as having their
proliferation, viability and increased osteogenesis, as demonstrated by the results of
MTT assay, FA, measurement of collagen and staining of mineralized structures.
Through analysis of the ectopic site implants and implants in rat calvarias lesions in
vivo, it was possible to show that the 3D matrix did not induce a strong inflammatory
response and did not affect the function of the implanted tissue. The matrix was shown
to be biocompatible and biodegradable, and allows the implant angiogenesis. When
colonized by ADSC, the implants had an early angiogenesis and a mature osteogenesis.
Furthermore, ADSC-EGFP were inserted into the newly formed ECM and visualized.
Thus, 3D matrices developed in this study showed promise for bone tissue engineering
and it is biocompatible, biodegradable and provides a good environment for the cell
attachment and proliferation, angiogenesis and osteogenesis. The union of the data
obtained for this work allows us to glimpse the possibility of using the 3D matrix of
chitosan, gelatin and chondroitin as a potential carrier for mesenchymal stem cells in
bone tissue engineering. Thus, our study opens a perspective for clinical application and
for future studies for the reconstruction of tissues.
Assunto
Biologia Celular, Células-Tronco Mesenquimais, Engenharia Tecidual, Matriz Extracelular de Substâncias Poliméricas, Quitosana, Osteogênese
Palavras-chave
Engenharia de Tecido, Matriz 3D, Quitosana, Célula-tronco, Osteogênese, Reparo ósseo
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