Caracterização de produtos de fotooxidação liídica em membranas miméticas gerados pela fotossensibilização com porfirazinas
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Tayana Mazin Tsubone
Adolfo Henrique de Moraes Silva
Adolfo Henrique de Moraes Silva
Resumo
Desde o primeiro relato feito por Thomas J. Dougherty em 1974, a terapia fotodinâmica (TFD) evoluiu consideravelmente para se tornar um protocolo médico consolidado por diversas agências de regulamentação. Atualmente, esse procedimento é prescrito para tratamento de inúmeras enfermidades, tais como diversos tipos de câncer, pé diabético, acne inflamatória, degeneração macular, entre outros. A TFD utiliza-se de um fotossensibilizador (FS) capaz de gerar espécies reativas quando na presença de oxigênio e luz visível. Tais espécies são responsáveis por oxidar biomoléculas e consequentemente induzir a morte celular. Durante o processo de fotossensibilização, os lipídeos que constituem as membranas são os principais alvos de oxidação, uma vez que essas estruturas representam a primeira barreira de entrada em células e organelas. Um estudo prévio mostrou que duas porfirazinas (Pzs) contendo os substituintes 3-trifluorometilfenil (3-CF3Pz) e 4-fluorofenil (4-FPz) apresentaram eficiência semelhante de produção de espécies reativas, porém demonstraram uma nítida diferença na eficiência de permeabilização de membranas miméticas. O motivo desta diferença não foi completamente elucidado e não se sabe ainda se isto afeta a fototoxicidade dos compostos em células tumorais. Dito isso, o principal objetivo deste trabalho é comparar a eficiência fotodinâmica das porfirazinas 3-CF3Pz e 4-FPz em células in vitro, e explicar eventuais diferenças por meio da identificação dos tipos de espécies radicalares e produtos formados durante o processo de fotooxidação lipídica. Para isso, as Pzs foram veiculadas em lipossomos de 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (POPC), di-oleil-fosfatidilcolina (DOPC) e fosfatidilcolina de soja (SOY 95%), na proporção de 0,5 mol% de FS e foram excitadas por diferentes fontes luminosas na região do vermelho a depender do experimento. Os ensaios para a detecção de espécies reativas foram feitos com espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e os produtos de fotooxidação lipídica foram caracterizados por espectrometria de massas por ionização por eletrospray (ESI-MS) e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG-MS). Foi analisada também a eficiência fotodinâmica dos compostos tanto em membranas miméticas, por meio do ensaio de vazamento de membrana acompanhado por medidas de fluorescência, quanto in vitro, utilizando-se ensaios de viabilidade celular para as linhagens celulares HaCaT e A431. Por fim, realizou-se um estudo conformacional e uma caracterização espacial dos compostos em membrana por meio de cálculos teóricos realizados no GROMACS. Quando carreados em lipossomos, observou-se que a 3-CF3Pz apresentou atividade fototóxica 3,6 vezes maior (IC50 = 0,23 μM) contra a A431 (linhagem tumoral) quando comparada a 4-FPz (IC50 = 0,83 μM). Estes dados estão em concordância com os dados do experimento de vazamento de membrana, no qual, após 30 minutos de irradiação, a permeabilização da 3-CF3Pz chegou a 96% contra apenas 16% da 4-FPz. Os dados de EPR não demonstraram uma diferença significativa na produção de espécies reativas de oxigênio para ambas as Pzs e os resultados de ESI-MS indicam que a produção de lipídeos hidroperoxidados também é similar. Todavia os resultados de CG-MS indicam que a 4-FPz possui uma eficiência maior na formação de ácidos graxos enquanto a 3-CF3Pz produz aldeídos lipídicos, espécies responsáveis pela permeabilização de membranas. Os dados de dinâmica molecular demonstram que após a hidroperoxidação lipídica, a 4-FPz tende a se localizar na parte hidrofílica dos lipídeos enquanto a 3-CF3Pz se difunde pela membrana até a região mais lipofílica, onde se concentram as insaturações lipídicas. Reações na insaturação que resultam em clivagem da cadeia carbônica induzem a formação de poros em membranas, o que justifica a maior eficiência fototóxica da 3-CF3Pz. Diante do exposto, conclui-se que há uma diferença significativa de fototoxicidade entre as Pzs, que pode estar associada à formação de lipídeos de cadeia curta, como aldeídos lipídicos, proveniente em parte do posicionamento assumido pela 3-CF3Pz após a hidroperoxidação lipídica que ocorre durante o processo de fotossensibilização das espécies.
Abstract
Since the first report by Thomas J. Dougherty in 1974, photodynamic therapy (PDT) has evolved significantly to become an established medical protocol recognized by various regulatory agencies. Today, this procedure is prescribed for the treatment of numerous conditions, including several types of cancer, diabetic foot ulcers, inflammatory acne, macular degeneration, among others. PDT relies on a photosensitizer (PS) capable of generating reactive species in the presence of oxygen and visible light. These species are responsible for oxidizing biomolecules and, consequently, inducing cell death. During the photosensitization process, the lipids that constitute biological membranes are the primary targets of oxidation, as these structures represent the first barrier for entry into cells and organelles. A previous study demonstrated that two porphyrazines (Pzs), bearing 3-trifluoromethylphenyl (3-CF3Pz) and 4-fluorophenyl (4-FPz) substituents, showed similar efficiencies in generating reactive species. However, they exhibited a clear difference in their ability to permeabilize model membranes. The reason for this discrepancy is still unknown, and it was not investigated yet if this difference impacts their phototoxicity in tumor cells. Considering this, the main objective of this work is to compare the photodynamic efficiency of 3-CF3Pz and 4-FPz in cells in vitro and to explain any differences through the identification of radical species and oxidation products formed during lipid photooxidation. For this purpose, the Pzs were incorporated into liposomes composed of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), and soybean phosphatidylcholine (SOY 95%) at a concentration of 0.5 mol% PS and were irradiated with red-region light sources depending on the experimental setup. Reactive species detection was performed using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, while lipid photooxidation products were characterized using mass spectrometry and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). Photodynamic efficiency was also assessed in model membranes through membrane leakage assays monitored by fluorescence, as well as in vitro using cell viability assays on HaCaT and A431 cell lines. Finally, a conformational and spatial characterization study of the compounds in membrane environments was carried out using theoretical calculations performed in GROMACS. When encapsulated in liposomes, 3-CF3Pz showed a 3.6-fold greater phototoxic activity (IC₅₀ = 0.23 μM) against A431 (tumor cell line) compared to 4-FPz (IC₅₀ = 0.83 μM). These results align with the membrane leakage assay, in which, after 30 minutes of irradiation, 3-CF3Pz induced 96% permeabilization, whereas 4-FPz reached only 16%. EPR data revealed no significant difference in oxygen reactive species production between the two Pzs, and ESI-MS results showed comparable levels of lipid hydroperoxides. However, GC-MS analysis indicated that 4-FPz is more efficient at producing fatty acids, while 3-CF3Pz favors the formation of lipid aldehydes, which are known to compromise membrane integrity. Molecular dynamics simulations demonstrated that following lipid hydroperoxidation, 4-FPz tends to reside in the hydrophilic region of the lipid bilayer, whereas 3-CF3Pz diffuses deeper into the lipophilic region, rich in unsaturated lipid chains. Reactions occurring at these unsaturations can lead to carbon chain cleavage and pore formation in membranes, thereby explaining the greater phototoxic efficiency of 3-CF3Pz. In conclusion, a significant difference in phototoxicity between the two Pzs was observed, which may be attributed to the formation of short-chain lipid species particularly lipid aldehydes arising, at least in part, from the preferential positioning of 3-CF3Pz following lipid hydroperoxidation during the photosensitization process.
Assunto
Química farmacêutica, Bioquímica, Fotoquimioterapia, Porfirina e compostos de porfirina, Fotoquímica, Carcinoma de células escamosas, Espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica, Lipídios
Palavras-chave
Tetraazoporfirinas, Câncer, Queratinócitos, Terapia fotodinâmica, Células escamosas