Caracterização bioquímica da Cutinase-Like de Cryptococcus flavus expressa em Komagataella phaffii para degradação de biopolímeros e aplicações biotecnológicas
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
João Ricardo Moreira de Almeida
Mateus Gomes de Godoy
Lucas Bleicher
Erich Birelli Tahara
Mateus Gomes de Godoy
Lucas Bleicher
Erich Birelli Tahara
Resumo
Mais de 350 milhões de toneladas de plástico são produzidos anualmente no mundo, dos quais 76% são descartados de forma incorreta. Os biopolímeros são uma alternativa a este problema ambiental. No entanto, são necessárias décadas para completa degradação dos biopolímeros em condições ambiente. Neste contexto, as cutinases são capazes de catalisar a hidrólise de ésteres de poliésteres, possuindo várias aplicações biotecnológicas, dentre elas, a hidrólise de biopolímeros como PBS, PLA, PLC e outros. A cutinase extracelular de Cryptococcus flavus I-11 (CfCLE) apresenta propriedades catalíticas importantes como resistência a solventes orgânicos e surfactantes, que podem viabilizar a aplicação biotecnológica desta enzima no processamento de biopolímeros. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar bioquimicamente a enzima CfCLE, produzida em sistema de expressão heterólogo de Komagataella phaffii, clonado sob o controle do promotor AOX1, a fim de aplicar biotecnologicamente a referida enzima. K. phaffii recombinantes foram geradas e triadas baseados na atividade enzimática e quantidade de proteínas, com intuito de selecionar o melhor transformante. Foram obtidas preparações enzimáticas com alto teor de pureza e atividade específica, por meio de processos escalonáveis de fermentação e de purificação. Os resultados de caracterização bioquímica da CfCLE recombinante (CfCLEr) demonstram que a proteína apresenta temperatura de atuação da enzima de 30°C e termo estabilidade até 50°C por 4 horas, pH de 8,5 e atividade na faixa de pH 6-11, resistência a vários solventes orgânicos como metanol e etanol, resistência a surfactantes como Triton e Tweens, aumento da atividade na presença de íons divalentes, maior especificidade para ésteres de 8 carbonos e triglicerídeos de 4 carbonos. Foi demonstrado neste trabalho que as preparações enzimáticas de CfCLEr purificada são capazes de catalisar a hidrólise de filmes PETs e de 84% de policaprolactona (PLC), 52% de ácido polilático (PLA) e 32% de polihidróxidobutirato (PHB), o que abre uma perspectiva para aplicação industrial na melhoria da degradação dos biopolímeros.
Abstract
More than 350 million tons of plastic are produced annually in the world, of which 76% are disposed of incorrectly. Biopolymers are an alternative to this environmental problem. However, decades are required for complete degradation of biopolymers under ambient conditions. In this context, cutinases are able to catalyze the hydrolysis of polyester esters, having several biotechnological applications, among them, the hydrolysis of biopolymers such as PBS, PLA, PLC and others. The extracellular cutinase of Cryptococcus flavus I-11 (CfCLE) has important catalytic properties such as resistance to organic solvents and surfactants, which may enable the biotechnological application of this enzyme in the processing of biopolymers. The objective of the present work was to biochemically characterize the CfCLE enzyme, produced in a heterologous expression system of Komagataella phaffii, cloned under the control of the AOX1 promoter, in order to biotechnologically apply this enzyme. K. phaffii recombinants were generated and screened based on enzymatic activity and amount of proteins, in order to select the best transformant. Enzyme preparations with high purity and specific activity were obtained through scalable fermentation and purification processes. The results of biochemical characterization of recombinant CfCLE (CfCLEr) demonstrate that the protein has an optimal temperature of 30°C and thermo stability up to 50°C for 4 hours, an optimal pH of 8.5 and activity in the pH range 6-11, resistance to various organic solvents such as methanol and ethanol, resistance to surfactants such as Triton and Tweens, increased activity in the presence of divalent ions, greater specificity for 8-carbon esters and 4-carbon triglycerides. It was demonstrated in this work that the enzymatic preparations of purified CfCLEr are able to catalyze the hydrolysis of PET films and 84% polycaprolactone (PLC), 52% polylactic acid (PLA) and 32% polyhydroxybutyrate (PHB), which opens a perspective for industrial application in improving the degradation of biopolymers.
Assunto
Bioquímica e imunologia, Biopolímeros, Cryptococcus, Enzimas, Hidrolases, Pichia
Palavras-chave
Cutinase, Biopolímeros, Cryptococcus flavus, Komagataella phaffii