Efeitos in vitro da Kisspeptina (KP-10) na diferenciação e expressão de marcadores osteogênicos de células tronco mesenquimais da medula óssea de ratas adultas
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Natália de Melo Ocarino
Milene Alvarenga Rachid
Milene Alvarenga Rachid
Resumo
A kisspeptina é um neuropeptídeo que se liga ao receptor GPR54 exercendo diversas funções no organismo, principalmente nos sistemas nervoso e reprodutor. Porém seus efeitos e mecanismos de ação no sistema esquelético permanecem pouco compreendidos. Este estudo avaliou o efeito de diferentes concentrações de kisspeptina (Kp-10) in vitro sobre a diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais (CTMs) extraídas da medula óssea (MO) de ratas Wistar adultas. Ratas de 2 meses de idade foram eutanasiadas para extração da MO de ossos longos para obtenção das CTMs. In vitro, foram estabelecidos 4 grupos experimentais: Controle e Kp-10 nas concentrações de 0,01μg/ml, 0,05μg/ml e 0,1μg/ml. Após a indução da diferenciação osteogênica, foram avaliadas a viabilidade celular pelo teste do MTT, atividade de fosfatase alcalina, síntese de colágeno, porcentagem de área coberta por CTMs/campo, nódulos mineralizados/campo, imunocitoquímica para o receptor GPR54 e avaliação da expressão gênica de colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, sialoproteína óssea, Runx-2 e BMP-2 por RT-PCR em tempo real. Observou-se que as CTMs durante a diferenciação osteogênica apresentam receptor GPR54 através do qual Kp-10 se liga promovendo um efeito direto negativo sobre a diferenciação osteogênica. Esse efeito foi observado em todas as concentrações utilizadas (0,01; 0,05 e 0,1 μg/ml) e de forma concentração-dependente, caracterizado pela diminuição da atividade da fosfatase alcalina, da síntese de colágeno, de nódulos mineralizados e pela diminuição da expressão de transcritos gênicos para colágeno tipo
I, osteocalcina, osteopontina e Runx-2. Dessa forma, concluímos que Kp-10 in vitro inibe a diferenciação osteogênica de CTMs extraídas da MO de ratas wistar adultas.
Abstract
Kisspeptin is a neuropeptide that binds to the GPR54 receptor, exerting several
functions mainly in the nervous and reproductive systems of the body. However, its
effects and mechanisms of action on the skeletal system remain poorly understood. This
study evaluated the effect of different concentrations of kisspeptin (Kp-10) in vitro on
the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) extracted from the
bone marrow (BM) of adult Wistar rats. Two-month-old female rats were euthanized to
extract BM from long bones to obtain MSCs. In vitro, 4 experimental groups were
established: control, and Kp-10 at concentrations of 0.01 µg/mL, 0.05 µg/mL and 0.1
µg/mL. After induction of osteogenic differentiation, cell viability was evaluated by the
MTT test, alkaline phosphatase activity, collagen synthesis, percentage of area covered
by MSCs/field, mineralized nodules/field, immunocytochemistry for the GPR54
receptor, and evaluation of gene expression of type I collagen, osteocalcin, osteopontin,
bone sialoprotein, RUNX-2, and BMP-2 were done by real-time RT-PCR. It was
observed that MSCs have a GPR54 receptor to which Kp-10 binds during osteogenic
differentiation, promoting a direct negative effect on osteogenic differentiation. This
effect was observed at all concentrations used (0.01, 0.05, and 0.1 µg/mL) and in a
concentration-dependent manner, characterized by a decrease in the activity of alkaline
phosphatase, collagen synthesis, mineralized nodules and by the decreased expression
of gene transcripts for type I collagen, osteocalcin, osteopontin, and RUNX-2. We
conclude that Kp-10 in vitro inhibits the osteogenic differentiation of MSCs extracted
from the BM of adult Wistar rats.
Assunto
Patologia, Neuropeptídeos, kisspeptinas, Células-Tronco Mesenquimais, Osteogênese, Roedores
Palavras-chave
Neuropeptídeo, CTMs, Diferenciação osteogênica, Roedores