Propriedades físico-químicas e biológicas de lipossomas termossensíveis de cisplatina funcionalizados com ácido hialurônico.
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Raquel Silva Araújo
Daniel Crístian Ferreira Soares
Marta Marques Gontijo de Aguiar
Lucas Antônio Miranda Ferreira
Daniel Crístian Ferreira Soares
Marta Marques Gontijo de Aguiar
Lucas Antônio Miranda Ferreira
Resumo
A administração continuada de cisplatina (CDDP), quimioterápico usado no tratamento de vários tipos de tumores sólidos, é limitada em função de reações adversas, como nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, neurotoxicidade, mielotoxicidade e ototoxicidade. Na tentativa de contornar esses inconvenientes e melhorar o índice terapêutico da CDDP, modificações farmacotécnicas têm sido propostas, como a encapsulação da CDDP em sistemas de liberação de fármacos, tais como os lipossomas. Nesse sentido, foi proposto o desenvolvimento de lipossomas termossensíveis de cisplatina não funcionalizado (LTS-CDDP), funcionalizado com ácido hialurônico (AH) por interação eletrostática (LTS-CDDP-AH-1) e funcionalizado com AH por ligação covalente (LTS-CDDP-AH-2), no intuito de proporcionar um direcionamento ativo para a região tumoral. Inicialmente foi realizado um estudo de caracterização das formulações desenvolvidas, por meio da associação das técnicas espalhamento dinâmico da luz (DLS), microcalorimetria e espalhamento de raio-X a baixo ângulo (SAXS). A taxa de encapsulação de CDDP foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência por um método de derivatização com dietilditiocarbamato. Em seguida, foi avaliada a citotoxicidade frente as células tumorais MDA-MB-231, bem como a toxicidade in vivo em camundongos Swiss sadios. Os resultados de caracterização mostraram diâmetro médio menor que 200 nm e índice de polidispersão (PDI) sugestivos de formulações homogêneas (< 0,2), indicando a ausência de agregação de vesículas mesmo após funcionalização com AH. A eficiência do revestimento na superfície do lipossoma foi atribuída a valores de potencial zeta próximos da neutralidade. Os dados de DLS mostraram uma redução significativa no diâmetro médio e contagem de partículas (Kcps) das formulações avaliadas a 40oC, e o revestimento com AH não alterou a temperatura de transição de fase das formulações. A encapsulação de CDDP foi de 9,3 ± 0,7% para LTS-CDDP-AH-2, 16,1 ± 1,9% para LTS-CDDP-AH-1 e 13,7 ± 0,9% para LTS-CDDP. O perfil obtido por SAXS para todas as formulações estudadas foi característico de uma organização lamelar independente da temperatura avaliada e apresentou dilatação da bicamada, causada por desorganização na estrutura dos lipídeos, confirmando a alteração conformacional devido ao aquecimento. No entanto, o perfil de liberação in vitro sugeriu uma possível adsorção do fármaco na bicamada fosfolipídica ocasionando uma taxa de difusão de CDDP antes de atingir a Tc (42oC), para LTS-CDDP e LTS-CDDP-AH-2. Para o LTS-CDDP-AH-1, a presença do polímero pode estar modulando essa difusão, gerando um perfil de liberação mais controlado e lento. Os resultados biológicos mostraram que LTS-CDDP apresentou maior citotoxicidade quando comparado com CDDP livre, além de levar ao aumento da ocorrência de senescência. O uso de hipertermia nos grupos tratados com LTS-CDDP e LTS-CDDP-AH-1 aumentou a ocorrência de apoptose em relação aos grupos sem hipertermia. No estudo in vivo, foi observado maior toxicidade da formulação catiônica para células saudáveis, sendo observado a ocorrência de nefrotoxicidade nos animais tratados com LTS-CDDP. Enquanto que, com o uso do ligante AH, os efeitos adversos conhecidos relacionados ao uso de CDDP foram eliminados, uma vez que os animais tratados com essa formulação não apresentaram alterações significativas nos exames hematológicos e bioquímicos, bem como nas análises histológicas. Sendo assim, a formulação de CDDP proposta, termossensível e contendo AH por interação eletrostática, apresenta características adequadas para tratamento do câncer por via intravenosa, em associação com hipertermia moderada, podendo ser capaz de reduzir a toxicidade relacionada a CDDP, representando uma alternativa potencial para veiculação desse fármaco.
Abstract
The continuous administration of cisplatin (CDDP), a chemotherapeutic agent used to treat
various types of solid tumors, is limited due to adverse reactions, such as nephrotoxicity,
hepatotoxicity, neurotoxicity, myelotoxicity, and ototoxicity. In an attempt to circumvent these
inconveniences and improve the therapeutic index of CDDP, pharmacotechnical modifications
have been proposed, such as the encapsulation of CDDP in drug delivery systems, like
liposomes. In this sense, it was proposed to develop a thermosensitive liposome of nonfunctionalized cisplatin (TSL-CDDP), functionalized with hyaluronic acid (HA) by
electrostatic interaction (TSL-CDDP-HA-1) and functionalized with HA by covalent bond
(TSL-CDDP-SA-HA-2), in order to provide an active targeting for the tumor region. Initially,
a detailed study was carried out to characterize the formulations developed, through the
association of dynamic light scattering (DLS), microcalorimetry, and low angle X-ray
scattering (SAXS) techniques. The CDDP encapsulation rate was evaluated by high
performance liquid chromatography using a diethyldithiocarbamate derivatization method.
Then, cytotoxicity against MDA-MB-231 tumor cells was evaluated, as well as in vivo toxicity
in healthy Swiss mice. The characterization results showed an average diameter less than 200
nm and a polydispersity index (PDI) suggestive of homogeneous formulations (< 0.2),
indicating the absence of vesicle aggregation even after functionalization with HA. The
efficiency of the HA-coating of liposome was attributed to values of zeta potential close to
neutrality. The DLS data showed a significant reduction in the mean diameter and Kcps (Kilo
counts per second) of the formulations evaluated at 40oC, and the coating with HA did not alter
the phase transition temperature of the formulations. CDDP encapsulation was 9.3 ± 0.7% for
TSL-CDDP-SA-HA, 16.1 ± 1.9% for TSL-CDDP-HA and 13.7 ± 0.9% for TSL -CDDP. The
profile obtained by SAXS for all the formulations studied was characteristic of a lamellar
organization independent of the evaluated temperature and presented dilation of the bilayer,
caused by disorganization in the lipid structure, confirming the conformational alteration due
to heating. However, the in vitro release profile suggested possible drug adsorption in the
phospholipid bilayer causing a diffusion rate of CDDP before reaching Tc (42oC), for TSLCDDP and TSL-CDDP-SA-HA. For TSL-CDDP-HA, the presence of the polymer may be
modulating this diffusion, generating a more controlled and slower release profile. The
biological results showed that TSL-CDDP have greater cytotoxicity when compared to free
CDDP, in addition to leading to an increase in the occurrence of senescence. The use of
hyperthermia in the groups treated with LTS-CDDP and LTS-CDDP-HA increased the
occurrence of apoptosis compared to groups without hyperthermia. In the in vivo study, greater
toxicity of the cationic formulation was observed for healthy cells, with the occurrence of
nephrotoxicity in animals treated with LTS-CDDP. While, with the use of the HA ligand, the
known adverse effects related to the use of CDDP were eliminated, since the animals treated
with this formulation did not show significant changes in hematological and biochemical tests,
as well as in histological analyzes. Thus, the proposed formulation of CDDP, thermosensitive
and containing HA by electrostatic interaction, has adequate characteristics for cancer treatment
intravenously, in association with moderate hyperthermia, and may be able to reduce CDDPrelated toxicity, representing a potential alternative for the delivery of this drug.
Assunto
Palavras-chave
Lipossoma termossensível, Ácido hialurônico, Cisplatina, Direcionamento ativo