Papel das espécies reativas de oxigênio durante a infecção por Leishmania infantum
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Milton Adriano Pelli Oliveira
Camilla Indiani
Wagner Tafuri
Maria de Fátima Martins Horta
Camilla Indiani
Wagner Tafuri
Maria de Fátima Martins Horta
Resumo
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um grupo de íons, radicais e moléculas contendo oxigênio reativo. Elas participam de vários processos biológicos desde biossíntese hormonal, sinalização celular, indução de morte celular por apoptose e eliminação de patógenos microbianos intracelulares. São produzidos por fagócitos quando apropriadamente estimulados. A enzima NADPH oxidase é responsável pela conversão de O2 em O2•- utilizando como doador de elétron o NADPH. Estudos demonstraram diferentes efeitos da ação de ROS em infecções causadas por parasitos do gênero Leishmania. Assim, no presente trabalho determinamos as diferentes espécies de oxigênio geradas por macrófagos quando infectados in vitro por Leishmania infantum. Além disso, avaliamos a influência da produção destes radicais no infiltrado celular nos estágios iniciais da infecção in vivo intradérmica por esse parasito. Nossos dados demosntram que na infecção de macrófagos por estes parasitos há a explosão respiratória, caracterizada pela produção de O2•- e acúmulo do H2O2 no sobrenadante das culturas celulares. Quando ativados por IFN-γ e LPS macrófagos produzem •NO. Quando previamente ativados e infectados, macrófagos foram capazes de produzir outra espécie reativa, o peroxinitrito (ONOO-). Nossos dados demonstram que estas diferentes espécies reativas de oxigênio e •NO são relevantes para a eliminação do parasito por macrófagos in vitro e também durante a infecção in vivo nos seus estágios iniciais. Assim, macrófagos de animais selvagens (WT) apresentaram menor percentual de infecção quando comparados aos macrófagos deficientes nas enzimas NADPH oxidase (Phox-/-) e óxido nítrico sintase (iNOS-/-) 72h após a infecção. Além disso, a produção de ROS e •NO nos estágios inicias da infecção in vivo compromete a replicação do parasito no local da infecção. Animais Phox-/- apresentaram maior susceptibilidade à infecção por L. infantum seguidos de iNOS-/- e por fim, com menor carga parasitária, os animais WT. Esta maior carga parasitária pode se relacionar também a diferenças no infiltrado celular inflamatório nos animais Phox-/- nos estágios
-/-
iniciais da infecção quando comparados aos animais WT e iNOS . A deficiência na
expressão da NADPH oxidase induziu maior migração de neutrófilos 12 horas após a infecção e estas células foram as responsáveis por carrear os parasitos neste tempo. Uma maior produção de CXCL1 e CXCL2 por animais Phox-/- 12h após a infecção associada aos índices aumentados de necrose em neutrófilos em relação aos WT pode explicar uma maior taxa de migração de neutrófilos nesses camundongos e a manutenção da diferença deste infiltrado nos tempos entre 24 e 72 horas. Além disso, uma menor migração de monócitos foi observada nesses animais. Dessa forma, descrevemos, pela primeira vez, que as espécies reativas de oxigênio influenciam, de diferentes formas, os estágios iniciais da infecção por L. infantum sendo essenciais na eliminação do parasito, modulação da produção de quimiocinas, migração diferencial de células e regulação da necrose de neutrófilos.
Abstract
Reactive oxygen species (ROS) are a group of ions, radicals and highly reactive
molecules derived from oxygen metabolism. They participate in many biological
processes from hormone biosynthesis, cell signaling and killing of microbial pathogens.
They are produced by phagocytes when properly stimulated. NADPH oxidase is the
enzyme responsible for the conversion of O2 to O2•- using NADPH as electron donor.
Several studies have shown different effects of ROS in infections caused by parasites
of the genus Leishmania. In the present work we focus on the determination of the
different oxygen species generated by macrophages when infected by Leishmania
infantum and the influence of these radicals in the early inflammatory cell infiltrate after
intradermal infection. We showed that L. infantum-infected macrophages produced
high levels of O2•- and we detected H2O2 in the supernatant of cell cultures. Moreover,
wild-type (WT)- and NADPH oxidase deficient (Phox-/-)-activated macrophages
produced similar amount of •NO. Besides, when activated and infected, only WT
macrophages produced peroxynitrite. Our data demonstrated that these different
oxygen species have an important effector role since there was decrease in the
percentage of infected cells. A difference was found when comparing the percentages
of infection between WT, Phox-/- and nitric oxide sintase deficient (iNOS-/-)
macrophages, suggesting an important role of peroxynitrite in the in vitro parasite
killing. The oxygen species produced by phagocytes play roles in the modulation of
protein expression and transcription factors, induction of cell death by apoptosis and
killing of parasites in vivo. Initially, we showed that there were differences in parasite
-/- -/- -/- and iNOS . Phox
load in WT, Phox
iNOS-/- and WT animals. We compared the cellular infiltrate influenced by the absence of expression of the enzyme NADPH oxidase and inducible nitric oxide synthase. The deficiency in the expression of NADPH oxidase induced larger neutrophil migration, peaking at 12 hours after infection. These cells were the main cell type harboring parasites at this time. The presence of the parasite induced apoptosis in neutrophils, but we did not find any differences between Phox-/- and WT mice. However, we found differences in neutrophil necrosis. Phox-/- mice showed more necrosis than WT in all time periods. Furthermore, neutrophil influx was coincident with higher levels of CXCL1and CXCL2 detected in Phox-/- but not in WT and iNOS-/- mice. We suggest that the
neutrophil maintenance at the site of infection in the times between 24 and 72 hours
-/-
was due the higher chemokine production and necrosis in Phox . Our data suggest
for the first time that reactive oxygen species directly influence the elimination of the parasite modulating chemokine production, differential cell migration and neutrophil necrosis regulation in the early stages of infection by L. infantum.
Assunto
Bioquímica e imunologia, Leishmaniose, Leishmania infantum, Espécies Reativas de Oxigênio
Palavras-chave
Leishmaniose, Leishmania infantum, Espécies reativas de oxigênio