Detecção de Listeria monocytogenes em leite: sensibilidade e especificidade de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
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Tipo
Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Marcelo Resende de Souza
Carla Christine Lange
Carla Christine Lange
Resumo
O objetivo deste trabalho foi detectar Listeria monocytogenes inoculada em leite, após um período de enriquecimento seletivo, por meio da técnica de PCR. Foi feita a padronização de uma PCR utilizando os oligonucleotídeos LM1/LM2 e de uma PCR multiplex com osoligonucleotídeos IAP1/IAP2 e LMA/LMB. Listeria monocytogenes foi inoculada em várias concentrações em leite esterilizado desnatado e em leite cru integral com dois níveis diferentes de contaminação. A PCR padronizada foi aplicada para identificar a bactéria inoculadaexperimentalmente e foi comparada com o método convencional de detecção de L. monocytogenes. Foram comparados, também, os métodos de extração de DNA utilizando fenolclorofórmio e por lise térmica, a partir de um caldo de cultura e diretamente da colônia suspeita. Somente foi possível identificar L. monocytogenes por PCR no leite esterilizado desnatado, após 48 horas de enriquecimento em meio seletivo (LEB). Neste caso, a sensibilidade do teste foi de 1 UFC/ml de leite, a mesma sensibilidade da metodologia convencional. Quando inoculada em leite cru integral com contaminação bacteriana, L. monocytogenes só foi detectada pela metodologia convencional, com uma sensibilidade de até 2 UFC/ml (leite com baixa contaminação). Foi possível reduzir o tempo de identificação de L. monocytogenes, substituindo os testes fenotípicos de identificação pela PCR padronizada, utilizando DNA bacteriano extraído pelo método de lise térmica, diretamente da colônia suspeita
Abstract
The aim of this work was to detect Listeria monocytogenes added in milk, after selectiveenrichment period, by PCR technique. A PCR technique using the primers LM1/LM2 and amultiplex PCR with IAP1/IAP2 e LMA/LMB was standardized. The conventional method of L.monocytogenes detection was compared from milk samples with different bacterial count addedwith various L. monocytogenes concentrations. The DNA extraction methods using phenolchloroformand thermal split were compared. The DNA extraction and the conventionalmethods showed the same result in detecting the bacterium in samples of sterilized milk. In milksamples with any initial contamination, the conventional methodology was sensitive and PCRfrom enrichment broth can not detect L. monocytogenes added, independently of the extractionmethod used. The identification time of L. monocytogenes decreased using the DNA extractionby the strain split method using suspect colonies that grew in Oxford and PALCAM, insubstitution of identification phenotypes tests
Assunto
Leite Análise, Listeria Identificação, Reação em cadeia de polimerase
Palavras-chave
leite cru, reação em cadeia de polimerase, Listeria monocytogenes, qualidade de leite