Balsas lipídicas são necessárias para a translocação do receptor lipídicas são necessárias para a translocação do receptor do fator de crescimento epidermal para o núcleo
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) regula processos
celulares de ligantes como o EGF e fator de crescimento transformante alfa
(TGF-α). Sua ativação inicia cascatas de sinalização que podem resultar em
proliferação, diferenciação, migração e sobrevivência celular. O EGFR é
internalizado após ativação e, inicialmente, pensava-se que este era um
mecanismo de regulação negativa da sinalização. Recentemente ficou
evidenciado que esse receptor pode translocar para o núcleo após estímulo
com ligantes, onde atua como fator de transcrição e transdutor de sinal. A
expressão anormal e/ou mutações do EGFR estão implicadas na progressão
de tumores sólidos de origem epitelial e seu bloqueio por anticorpos
monoclonais (mAbs) é um alvo importante na terapia contra o câncer. No
entanto, dados recentes apontaram que o EGFR nuclear (nEGFR) está
envolvido na resistência adquirida ao tratamento com mAbs e essa localização
do receptor representa maior valor prognostico para pacientes com certos tipos
de tumores. Apesar da importância do nEGFR ter sido demonstrada, o
mecanismo pelo qual o receptor é internalizado e chega ao núcleo não está
esclarecido. Assim, o presente trabalho tem como objetivo identificar a via
endocítica que medeia a translocação do EGFR para o núcleo. Foram
utilizadas células endoteliais de tumor hepático humano SKHep-1, as quais
expressam altos níveis de EGFR. Nestas células a internalização e a
translocação para o núcleo foi avaliada por western blot e EGF marcado com
Alexa 488 ou 555. Assim foi demonstrado que o EGFR transloca para o núcleo
com um pico de translocação entre 5-10 minutos de estímulo com EGF. O
papel da dinamina nesse processo foi avaliado através do uso do dominante
negativo K44A. Empregando a técnica de siRNA, avaliou-se a dependência de
clatrina e caveolina na endocitose do EGFR. A comprovação da dependência
de balsas lipídicas nesse processo foi realizada com a utilização de metil-betaciclodextrina (MβCD). Como resultado, identificou-se que a translocação do
EGFR para o núcleo é dependente de dinamina e caveolas/balsas lipídicas.
Além disso, foi demonstrado que a translocação nuclear do EGFR não
depende de endocitose mediada por clatrina.
Abstract
The epidermal growth factor receptor (EGFR) regulates cellular process
of ligands such as EGF and transforming growth factor alpha (TGF-α). Upon
activation EGFR initiates signaling cascades that can result in cell proliferation,
differentiation, migration and survival. Recently it was shown that EGFR can be
translocated to the nucleus after ligand stimulation, where it acts as a
transcription factor and signal transducer. Abnormal expression and/or
mutations of EGFR are implicated in the progression of ephitelial-derived solid
tumors and its block by monoclonal antibodies (mAbs) is an important target for
cancer therapy. However, recent data point that nuclear EGFR (nEGFR) is
involved in acquired resistence to mAbs and this localization of the receptor
represent a major prognostic value for patients with some kind of tumors.
Regardless of the nEGFR importance has been demonstrated, the mechanisms
by which this receptor is translocated to the nucleus is not clear. Thus, the
present study aimed to identify the endocytic pathway that mediates the nuclear
translocation of EGFR. SKHep-1 cells, a liver cell line, was used. To determine
differences in the subcellular distribution of EGFR after EGF stimulation,
nuclear and non-nuclear cell fractions were analyzed by immunoblot and by real
time imaging and confocal immunofluorescence. Small interference RNA was
used to knockdown clathrin and caveolin. Intracellular trafficking of EGF was
examined by time lapse confocal imaging of EGF labeled with Alexa 488 or 555.
Cell fractionation studies showed that EGFR was detectable in the nucleus after
EGF stimulation, with a peak in nuclear receptor after 10 min. Movement of
EGFR to the nucleus was confirmed by confocal immunofluorescence. Alexalabeled EGF co-localized with EGFR, and internalization of labeled EGF was
blocked by treatment with caveolin siRNA. EGF internalization also was
impaired by the dynamin dominant negative mutant K44A. Cell fractionations
furthermore showed that appearance of EGFR in the nucleus could be blocked
by either Methyl-beta-Cyclodextrin (MβCD) to disrupt lipid rafts or treatment with
caveolin siRNA. However, knockdown of clathrin with siRNA did not block
nuclear accumulation of EGFR.
Assunto
Bioquímica e imunologia, Receptores ErbB
Palavras-chave
EGFR, Transcrição e transdutor de sinal, SKHep-1