Avaliação da ativação de apoptose e autofagia como mecanismo de citotoxicidade induzida por um nitrocomposto e uma hidrazona em células tumorais humanas
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Adriana Abalen Martins Dias
Helen Lima Del Puerto
Helen Lima Del Puerto
Resumo
A busca por novos fármacos antitumorais é uma necessidade principalmente devido
aos tratamentos atuais apresentarem alta toxicidade, baixa efetividade e
aparecimento de resistência em alguns tipos de cânceres. No processo de
descoberta de fármacos, compostos de diferentes classes químicas são avaliados
em modelos preditivos para seleção dos mais ativos. Estes são submetidos a
melhoramento químico e estudos da relação estrutura-atividade (REA) para
obtenção dos candidatos mais promissores. Neste trabalho, realizamos uma
investigação do potencial antitumoral e elucidação do mecanismo de ação de duas
substâncias: uma hidrazona (E6) e um nitrocomposto (EBAC). Essas substâncias
demonstraram baixa toxicidade em modelos de células normais como Vero e de
sangue periférico humano (PBMC). A avaliação do mecanismo de ação foi realizada
na linhagem humana leucêmica (HL60) através de cinética de tempo por
microscopia de contraste de fase e liberação de LDH, sendo possível verificar que
as células HL60 apresentavam aspectos compatíveis com apoptose após tratamento
com as duas substâncias. Fragmentação de DNA foi confirmada após 24 horas de
tratamento por citometria de fluxo com marcação com PI, análise em gel de agarose
e por observação dos núcleos após marcação com Hoescht 33342. Ensaios com
inibidor de caspases Z-VAD-FMK, Anexina V e PI, quantificação de espécies
reativas de oxigênio, ativação de caspase-3 confirmaram morte por apoptose
induzida pelas duas substâncias.Perda do potencial de membrana mitocondrial e
detecção de caspase -9 sugerem apoptose por meio de ativação da via mitocondrial
nessa linhagem leucêmica. Diferenças no mecanismo de morte foram observadas
para a EBAC que induziu acúmulo de vacúolos autofágicos após análise com
alaranjado de acridina e aumento da quantidade de células viáveis após utilização
do inibidor de autofagia Bafilomicina A1. Estes resultados são sugestivos de que
EBAC induziu autofagia e apoptose simultaneamente, o que não foi observado para
E6. Os resultados em conjunto demonstram que as substâncias EBAC e E6 são
substâncias promissoras com potencial antitumoral e se justifica a continuidade de
estudos de relação estrutura-atividade para obtenção de derivados mais ativos.
Abstract
The search for new antitumor drugs is a necessity mainly due to current treatments
present high toxicity, low effectiveness and emergence of resistance in some types of
cancers. In the process of drug discovery, compounds of different chemical classes
are assessed in models predictive and selected for chemical optimization and studies
of structure-activity relationship (SAR) to obtain the most promising candidates. We
carried out an investigation of mechanism of action and the antitumor potential of two
substances: a hydrazone (E6) and nitrocomposto (EBAC). These substances
showed low toxicity for normal cells such as human peripheral blood mononuclear
cell (PBMC). The evaluation of the mechanism of action was performed on leukemic
cell line (HL60) by phase contrast microscopy and LDH release, being able to verify
that HL60 cells had features consistent with apoptosis after EBAC and E6 treatment.
DNA fragmentation was confirmed after 24 hours of treatment by cell cycle, DNA
electrophoresis and fluorescence microscopy after Hoechst 33342-staining. The use
of pan-caspase inhibitor (Z-VAD-FMK), Annexin V and PI, quantification of reactive
oxygen species and caspase-3 activation confirmed apoptosis. Loss of the
mitochondrial membrane potential and caspase -9 detection suggest mitochondrial
pathway activation in this cell line. Differences in the mechanism of death were
observed for EBAC that induced accumulation of autophagic vacuoles analysis after
acridine orange and increasing the amount of viable cells after use of the autophagy
inhibitor bafilomycin A1. These results suggest that EBAC induced autophagy and
apoptosis simultaneously, which was not observed for E6. The results together show
that EBAC and E6 are promising substances with anti-tumor potential and justify the
continuation of studies of structure-activity relationship for obtaining more active
derivatives.
Assunto
Farmacologia, Apoptose, Fármacos, Nitrocompostos
Palavras-chave
Atividade citotóxica, Apoptose, Hidrazona, Nitrocomposto
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