Estudo de proteínas induzidas por glicocorticoides: papel de GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) e Anexina A1 na resolução da inflamação aguda
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Ester Roffe Santiago
Sandra Helena Poliselli Farsky
Caio Tavares Fagundes
Gustavo Batista de Menezes
Sandra Helena Poliselli Farsky
Caio Tavares Fagundes
Gustavo Batista de Menezes
Resumo
A resposta inflamatória é caracterizada pela liberação inicial de mediadores pró-inflamatórios
e migração de leucócitos para o local da lesão em resposta a um estímulo estéril ou causado
por patógenos. No entanto, a inflamação não controlada e persistente pode ser causa de
doenças inflamatórias crônicas, sistêmicas ou autoimunes com eventual perda de função do
órgão afetado, uma vez que proteases presentes nos grânulos dos neutrófilos podem perpetuar
a inflamação por atuarem como agente flogístico. Desta forma, este processo deve ser
finamente controlado pela ação de mediadores anti-inflamatórios e/ou pró-resolutivos e de
anti-proteases endógenas que auxiliam na resolução do processo inflamatório e no retorno da
homeostase tecidual. Nos últimos anos o estudo de agonistas da resolução, objetivando o
encontro de moléculas que atuam na fase produtiva e resolutiva da inflamação, tem ganhado
muita importância com as descobertas de moléculas pró-resolutivas lipídicas e proteicas.
Dentre esses mediadores, destacam-se GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) e
anexina A1 (AnxA1), duas proteínas induzidas por glicocorticoides (GCs) que medeiam
diversas funções desta classe de fármacos. Assim, o presente trabalho investigou a
participação de GILZ e AnxA1, bem como o efeito de anti-proteases naturais e sintéticas, na
resolução da resposta inflamatória aguda. Para tal, foi utilizado o modelo murino de pleurisia
induzida por LPS em camundongos BALB/c. Após a injeção de LPS na cavidade pleural dos
animais, as células presentes no lavado pleural foram coletadas em diferentes intervalos pósinjeção
e analisadas. Foi observado um aumento da expressão de GILZ e AnxA1 durante a
fase resolutiva da pleurisia, especialmente em macrófagos com fenótipos resolutivos. O
tratamento profilático ou terapêutico de camundongos injetados com LPS com o peptídeo
TAT-GILZ (permite a liberação de GILZ in vivo) melhorou os índices de resolução, diminuiu
os níveis de citocinas e promoveu a apoptose de neutrófilos. O peptídeo TAT-GILZ também
diminuiu a ativação/acúmulo das proteínas associadas com sobrevivência celular ERK1/2,
NF-B e Mcl-1. Em camundongos deficientes em GILZ (GILZ-/-) a resolução da inflamação
foi associada a um aumento precoce de AnxA1 sem modificação no influxo de neutrófilos
induzida por LPS. Dexametasona (Dex) resolveu a inflamação induzindo a expressão de
GILZ, cuja expressão foi dependente AnxA1. A resolução induzida por Dex não foi alterada
em camundongos GILZ-/-, devido ao aumento compensatório da expressão de AnxA1. Estes
resultados mostram que embora deficiência de GILZ seja compensado pelo aumento de
AnxA1 a administração terapêutica de GILZ induz um programa pró-apoptótico eficaz em
neutrófilos promovendo a resolução de inflamação neutrofílica induzida por LPS. Quanto ao
estudo do balanço de proteases/anti-proteases, durante a cinética de resolução AnxA1 intacta
foi detectada nas células desafiadas com PBS, e a sua clivagem foi máxima entre 8-24 horas
após LPS, quando o recrutamento de neutrófilos e a expressão e a atividade de elastase foi
máxima. A expressãõ de AnxA1 intacta assim como de anti-proteases endógenas (SLPI -
secretory leukocyte protease inhibitor e Elafina) foi aumentada durante a fase resolutiva da
inflamação. O tratamento de camundongos com SLPI e Elafina promoveu a resolução da
inflamação associada com aumento de neutrófilos apoptóticos e aumento de AnxA1 intacta no
interior da cavidade pleural. De maneira semelhante, o inibidor sintético de elastase,
Sivelestat, promoveu a resolução da inflamação associada à prevenção de clivagem de AnxA1
e aumento da apoptose de neutrófilos dependente de caspases. De forma importante,
Sivelestat aumentou o número de macrófagos com fenótipos resolutivos e a eferocitose de
neutrófilos apoptóticos. A neutralização de AnxA1 utilizando um anticorpo neutralizante ou o
bloqueio do seu receptor aboliu o efeito pró-resolutivo induzido por Sivelestat. Estes
resultados mostram que a inibição de elastase por anti-proteases promove a resolução da
inflamação associada com o aumento dos níveis de AnxA1 intacta e apoptose. Tomados em
conjunto, estes dados mostram que proteínas induzidas por GCs ou estratégias terapêuticas
que aumentam seus níveis podem se constituir em uma estratégia interessante para o controle
de doenças inflamatórias
Abstract
The inflammatory response is characterized by the initial release of pro-inflammatory
mediators and migration of leukocytes to the site of injury in response to sterile stimulus or
caused by pathogens. However, persistent or uncontrolled inflammation may be cause of
chronic inflammatory, systemic or autoimmune diseases with eventual loss of function of the
affected organ, since proteases present in the granules of neutrophils can perpetuate
inflammation by acting as phlogistic agent. Thus, this process must be finely controlled by the
action of anti-inflammatory and/or pro-resolving mediators and endogenous anti-proteases
that assist in resolution of the inflammatory process and the return of tissue homeostasis. In
recent years the study of agonists of the resolution, aiming to find molecules that act in the
production and termination phase of inflammation, has gained much importance to the
findings of lipid and protein pro-resolving molecules. Among these mediators, are highlighted
GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) and annexin A1 (AnxA1), proteins induced by
glucocorticoids (GCs) that mediate various functions of this class of drugs. The present study
investigated the participation of GILZ and AnxA1, and the effect of natural and synthetic antiproteases in the resolution of the acute inflammatory response. For this purpose, it was used
the murine model of LPS-induced pleurisy in BALB/c mice. Subsequently, the cells in the
pleural fluid were collected at different post injection intervals and analyzed. It was observed
that GILZ and AnxA1 expression was increased during the resolution phase of pleurisy,
especially in macrophages with resolutive phenotypes. The prophylactic or therapeutic
treatment of mice injected with LPS with the peptide TAT-GILZ (allows the in vivo delivery
of GILZ), improved resolution indices, decreased cytokine levels, and promoted apoptosis of
neutrophils. TAT-GILZ also decreased the activation/accumulation of the survival proteins
ERK1/2, NF-B and Mcl-1. In deficient GILZ (GILZ-/-) mice the resolution of inflammation
was associated with an early increase of AnxA1 without changing the influx of neutrophils
induced by LPS. Dexamethasone (Dex) solved inflammation inducing GILZ expression,
which was dependent of AnxA1. The resolution induced by Dex has not changed in GILZ-/-
mice due to a compensatory increase AnxA1 expression. These results shows that despite
GILZ deficiency are offset of AnxA1 increase, the therapeutic administration of GILZ
effectively induces a pro-apoptotic program by promoting resolution of neutrophilic
inflammation induced by LPS. As regards the study of the balance of protease/anti-protease
during kinetic resolution, intact AnxA1 was detected in cells challenged with PBS, and its
cleavage was maximal between 8-24 hours after LPS, when the recruitment of neutrophils and
the expression and elastase activity was maximal. The AnxA1 expression as well as
endogenous antiproteases expression (SLPI - secretory leukocyte protease inhibitor and
Elafin) was increased during the resolution phase of inflammation. Treatment of mice with
SLPI and Elafin promoted the resolution of inflammation associated with increased apoptotic
neutrophils and intact AnxA1 in the pleural cavity. Similarly, the synthetic inhibitor of
elastase Sivelestat, promoted the resolution of inflammation associated with prevention of
AnxA1 cleavage and increased neutrophil apoptosis in a caspases dependent manner.
Importantly, Sivelestat incresased the number of macrophages with resolutive phenotype and
efferocytosis of apoptotic neutrophils. The AnxA1 neutralization using a neutralizing
antibody or blocking its receptor abolished the effect induced by Sivelestat. These results
show that inhibition of elastase by anti-proteases promote the resolution of inflammation
associated with increased levels of intact AnxA1 and apoptosis. Taken together, these data
show that proteins induced by GCs or therapeutic strategies which increases their levels may
constitute an interesting strategy to the control of inflammatory diseases.
Assunto
Biologia Celular, Inflamação, Glucocorticoides, Anexina A1
Palavras-chave
Biologia Celular
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