Swine Influenza Virus: Standardization of a RT-PCR and subtyping of field samples circulating in Brazil from 2012-2018

Abstract

O vírus influenza A (IAV) causa doença respiratória aguda em suínos, caracterizada por alta morbidade nos rebanhos. Os IAVs possuem RNA segmentado de senso negativo, contribuindo para mutações e rearranjos genéticos do vírus. As glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos da resposta imune do hospedeiro, e mutações nas mesmas contribuem para a diversidade genética do IAV. Três subtipos do vírus da influenza suína (SIV) circulam mundialmente nos suídeos: H1N1, H1N2 e H3N2. A rápida identificação dos subtipos é importante para monitorar o SIV, auxiliando na detecção de possíveis surtos e variações antigênicas virais. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste de RT-PCR para detectar subtipos de SIV presentes no Brasil, analisando suas distribuições combinada a dados sorológicos dos anos de 2012-2018. O delineamento de primers específicos para regiões de HA, foi realizado a partir de sequências de amostras brasileiras previamente depositadas no GenBank. Amostras caracterizadas de H1N1pdm09, H3N2 e H1Delta foram utilizadas como referências. Realizou-se uma primeira (One Step RT-PCR) e uma segunda (Nested PCR) reação para padronizar o teste. Noventa e duas amostras de campo, positivas para IAV, dos anos de 2012 a 2018, foram utilizadas para validar o RT-PCR. A sensibilidade foi avaliada a partir do teste de limite de detecção e a especificidade a partir de ensaios de primers cruzados nas amostras controle. Os produtos de PCR amplificados, a partir das amostras de campo, foram sequenciados, realizando-se a análise filogenética, bem como o cálculo do p-distance entre amostras de mesmo subtipo. Sequências parciais de HA, das amostras de H1pdm do estudo e de amostras de outros anos, foram traduzidas e comparadas. Subtipagem do gene N de amostras positivas para H1Delta foi executada. Realizou-se análises sorológicas em 949 amostras de soro obtidas nos anos de 2017-2018, avaliando a presença de anticorpos contra H1N1pdm09 e H3N2 pelo teste de Inibição da Hemaglutinação (HI). O teste Nested foi mais sensível que a reação One-step. Não houve amplificação cruzada inespecífica. Setenta e uma (71/92-77%) das amostras de campo foram subtipadas pelo Nested RT-PCR, sendo 14 (14/71-20%) coletadas em 2012-2013, 35 (35/71-49%) em 2014-2015, e 22 (22/71-31 %) em 2017-2018. Em 2012- 2015, a maioria foram positivas para H1N1pdm09, seguido de H1Delta e H3N2, havendo também co-infecção de H1N1pdm09+H3N2 e H1N1pdm09+H1Delta. Em 2017-2018 observou-se mais amostras positivas para H1Delta, seguido de H1N1pdm e H3N2, sendo coinfecção também foi observada. Das amostras positivas para H1Delta, apenas 57% (12/21) foram subtipadas para o gene N, a maioria positiva para N2. Das amostras de soro analisadas, 716 foram positivas para IAV, e em 2017 e 2018 a ocorrência de H3N2 foi maior que a de H1N1pdm09 bem como a co-infecção por H1N1pdm09 e H3N2. Pela análise filogenética, sequências parciais de cada subtipo analisado se agruparam em grupos semelhantes. Na análise de p-distance identificou-se dissimilaridade entre as amostras de H1Delta e de H1N1pdm09 nos períodos analisados. O alinhamento de aminoácidos de sequências parciais de H1N1pdm de diferentes anos, mostraram variações residuais, especialmente em sítios antigênicos. A técnica de Nested RT-PCR mostrou-se rápida, sensível e específica, sendo recomendada para a subtipagem de SIV. Existe a circulação de quatro subtipos de SIV no Brasil. Nos anos de 2012- 2015 uma maior ocorrência de H1N1pdm foi evidenciada, porém o H3N2 foi o mais observado em 2017-2018. A análise de resíduos de aminoácidos das sequências de H1N1pdm demonstrou substituições pontuais entre amostras de diferentes anos, sugerindo a evolução do vírus ao longo do tempo. Estudos relacionados à caracterização genética de SIVs circulantes no Brasil são essenciais para entender a evolução dos vírus e suas características antigênicas.