Diagnóstico sorológico da Leishmaniose Tegumentar utilizando peptídeos sintéticos como antígenos
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
A Leishmaniose Tegumentar apresenta uma ampla diversidade clínica com variabilidade no espectro de gravidade, o que dificulta o diagnóstico clínico. O tratamento efetivo e o controle das leishmanioses dependem de um diagnóstico acurado e precoce, de maneira a evitar o desenvolvimento de doenças crônicas e/ou de lesões desfigurantes. Diferentes métodos de diagnóstico são usados para a confirmação da doença, entretanto, o diagnóstico utilizando os métodos disponíveis, apresentam dificuldades seja na coleta do material, execução da técnica ou ainda na conclusão do resultado. Nesse contexto antígenos purificados sintéticos ou recombinantes têm sido identificados com objetivo de melhorar o diagnóstico dessa parasitose. No presente trabalho, realizamos a seleção e síntese de peptídeos para serem testados em diagnóstico sorológico da LT. Os peptídeos foram selecionados por mapeamento de epitopos para células B detectados simultaneamente por dois softwares, BCPreds e ABCpred, em 6 proteínas identificadas por nosso grupo como promissoras para diagnóstico da LT. Dessa forma 20 sequencias foram sintetizadas e procedemos a triagem dos antígenos com “pool” de soros positivos e negativos e selecionamos 9 peptídeos com um índice de reatividade (IR) superior a 1,5. Os métodos ELISA e CLIA utilizando esses 9 peptídeos foram avaliados quanto a sensibilidade (S), especificidade (E), valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN) e área sob a curva (AUC) com soro de pacientes com LT(n=30) e saudáveis (n=29). Avaliamos também reações cruzadas utilizando soros de pacientes com leishmaniose visceral (n=30), paracocciodomicose (n=8) e esporotricose (n=10). A reação de ELISA com o peptídeo BT7 apresentou os melhores resultados, com elevada AUC= 0,934, S=88%, E= 97%, VPP =97%, VPN =88% (p <0,0001), e baixo índice de reação com LV (3%) e ausência de reação com soro de pacientes com paracocciodomicose e esporotricose. O melhor resultado no CLIA foi obtido com o peptídeo HS3 que apresentou elevada AUC= 0,909, S= 94%, E= 77%, VPP =75%, VPN =94% (p <0,0001) e, apesar do elevado índice de reação com LV (96%), não apresentou reação cruzada com paracocciodomicose e baixo índice de reatividade com esporotricose (12%). Além disso, a combinação dos peptídeos BT7 e EL1 aumentou a eficácia dos testes, sendo que essa combinação no ELISA mostrou superioridade ao CLIA, com AUC de 0,971, sensibilidade de 96%, especificidade de 88%, VPP de 92% e VPN de 94%. No CLIA, a combinação dos antígenos BT7 e EL1 não apenas melhorou a especificidade, mas também manteve a AUC obtida com os antígenos isolados. Esses resultados sugerem novos potenciais antígenos para diagnóstico sorológico da LT.
Abstract
Cutaneous leishmaniasis presents a broad clinical spectrum with variability in severity, which complicates the clinical diagnosis. Effective treatment and control of leishmaniasis rely on accurate and early diagnosis to prevent the development of chronic conditions and/or disfiguring lesions. Various diagnostic methods are used to confirm the disease; however, these methods often encounter difficulties in material collection, technique execution, and result interpretation. In this context, synthetic or recombinant purified antigens have been explored to enhance the diagnosis of this parasitosis.In this study, we selected and synthesized peptides for testing in the serological diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). Peptides were chosen by mapping epitopes for B cells detected simultaneously using two software programs, BCPreds and ABCpred, across six proteins identified by our group as promising for CL diagnosis. Consequently, 20 sequences were synthesized, and the antigens were screened with a pool of positive and negative sera. We selected 9 peptides with a reactivity index (RI) greater than 1.5. We evaluated the sensitivity (S), specificity (E), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), and area under the curve (AUC) of the ELISA and CLIA methods using these 9 peptides. Additionally, we assessed cross-reactions with sera from patients with visceral leishmaniasis (n=30), paracoccidioidomycosis (n=8), and sporotrichosis (n=10).In the ELISA assay, the BT7 peptide exhibited the best performance, with a high AUC of 0.934, sensitivity of 88%, specificity of 97%, PPV of 97%, and NPV of 88% (p < 0.0001). It showed a low reaction rate with leishmaniasis (3%) and no reaction with sera from patients with paracoccidioidomycosis and sporotrichosis. The best result in the CLIA method was achieved with the HS3 peptide, which demonstrated a high AUC of 0.909, sensitivity of 94%, specificity of 77%, PPV of 75%, and NPV of 94% (p < 0.0001). Despite a high reaction rate with leishmaniasis (96%), this peptide showed no cross-reactivity with paracoccidioidomycosis and a low reactivity rate with sporotrichosis (12%).Furthermore, combining the BT7 and EL1 peptides improved test efficacy. The combination in ELISA showed superior performance compared to CLIA, with an AUC of 0.971, sensitivity of 96%, specificity of 88%, PPV of 92%, and NPV of 94%. In CLIA, the combination of BT7 and EL1 antigens not only improved specificity but also maintained the AUC achieved with the individual antigens. These results suggest new potential antigens for the serological diagnosis of cutaneous leishmaniasis.
Assunto
Parasitologia, Leishmaniose Tegumentar Difusa, Testes Sorológicos, Vacinas Sintéticas
Palavras-chave
Lishmaniose, Peptídeo, Sintético, Diagnóstico