Nanobastões de ouro biofuncionalizados com angiotensina-(1-7) como nanoplataforma para tratamento da isquemia cerebral
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
Nanobastões de ouro (GNRs - do inglês Gold Nanorods, aqui denominados RODs) possuem propriedades ópticas e eletrônicas singulares e têm sido propostos como nanocarreadores, uma vez que podem transportar biomoléculas para tecidos-alvo com eficácia. A Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], um heptapeptídeo do Sistema Renina-Angiotensina, tem demonstrado resultados promissores no tratamento de diversas doenças, como o Acidente Vascular Encefálico (AVE) isquêmico. No entanto, os efeitos terapêuticos da Ang-(1-7) tem duração curta devido à rápida degradação em meio biológico ou in vivo. Portanto, a biofuncionalização da Ang-(1-7) com RODs pode aumentar sua biodisponibilidade. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar as ações neuroprotetoras dos RODs carreando Ang-(1-7) em um modelo de isquemia in vitro, usando a Privação de Oxigênio e Glicose (OGD). Os RODs foram sintetizados, peguilados e posteriormente biofuncionalizados com Ang-(1-7). Após, foram caracterizados usando espectroscopia UV-Vis, Potencial Zeta e Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). A taxa de ligação da Ang-(1-7) ao ROD foi medida utilizando um espectrofotômetro tipo Nanodrop. Utilizaram-se fatias hipocampais de 76 camundongos CD1 machos, com idade entre 9 e 11 semanas (CEUA/UFMG: 269/2020 e 88/2024), para o protocolo de OGD. As fatias foram divididas em dois grupos, nOGD e OGD. O primeiro foi colocado em fluido cérebro espinhal artificial (ACSF) com glicose e aerado com O2. Já o segundo, no período da isquemia (60 min), recebeu ACSF sem glicose e aerado com N2, e durante a reperfusão (120 min), houve o retorno do O2 e da glicose. Foram realizadas análises bioquímicas de lactato desidrogenase (LDH), para a análise da viabilidade celular, e liberação de glutamato. Os resultados foram analisados usando ANOVA de duas vias (p<0,05), seguido de post-hoc de Tukey. Os RODs apresentaram dimensões de comprimento x diâmetro (nm): 24,7 x 11,1 e área total de 1250 nm2. As características físicas de ROD-CTAB, ROD, ROD + Ang-(1-7) foram as seguintes, respectivamente: LSPRT λmáx (nm): 517; 519; 519; LSPRL λmáx (nm): 644; 648; 645; concentração (nM): 16,6; 9,5; 0,6; a carga medida através do PZ (mV) para os ROD e ROD + Ang-(1-7) foi de: +7,77; +31,1, respectivamente. A taxa de ligação da Ang-(1-7) ao ROD foi de 40%. Na análise de viabilidade celular, no período da isquemia, foi observada menor liberação de LDH nos grupos ROD + Ang-(1-7) nas concentrações 1,5 nM (p = 0,0019) e 15 nM (p = 0,0085), em relação aos seus controles, assim como aconteceu com o grupo Ang-(1-7) livre (p = 0,0010). Essa menor liberação também foi observada para liberação de glutamato nos grupos ROD + Ang-(1-7) nas concentrações 1,5 nM (p = 0,0215) e 15 nM (p = 0,0259), em
relação aos seus controles, e também no grupo Ang-(1-7) livre (p = 0,0191). Não foram encontradas diferenças significativas na expressão das caspases 9 e 3, e os resultados da biodistribuição revelaram a presença de ouro no fígado. Nossos resultados indicaram síntese e biofuncionalização bem sucedidas dos RODs com Ang-(1-7), além de demonstrar neuroproteção no modelo de isquemia-reperfusão in vitro. Futuramente, espera-se que o ROD com Ang-(1-7) possa ser utilizado como uma estratégia de carreamento e administração de Ang-(1-7), por ser mais efetivo que a Ang-(1-7) livre, aumentando sua biodisponibilidade, em um modelo in vivo.
Abstract
Gold nanorods (GNRs - from the English term Gold Nanorods, here referred to as RODs) exhibit unique optical and electronic properties and have been proposed as nanocarriers due to their ability to effectively transport biomolecules to target tissues. Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)], a heptapeptide from the Renin-Angiotensin System, has shown promising results in the treatment of various diseases, such as ischemic stroke. However, the therapeutic effects of Ang-(1-7) are short-lived due to its rapid degradation in biological media or in vivo. Therefore, biofunctionalization of Ang-(1-7) with RODs can enhance its bioavailability. This study aimed to evaluate the neuroprotective actions of RODs carrying Ang-(1-7) in an in vitro model of stroke, applying Oxygen-Glucose Deprivation (OGD). The RODs were synthesized, PEGylated, and subsequently biofunctionalized with Ang-(1-7). They were characterized using UV-Vis spectroscopy, Zeta Potential, and Transmission Electron Microscopy (TEM). The binding rate of Ang-(1-7) to RODs was measured using a Nanodrop spectrophotometer. Hippocampal slices from 76 male CD1 mice, aged 9-11 weeks (CEUA/UFMG: 269/2020 and 88/2024), were used for the OGD protocol. The slices were divided into two groups, nOGD and OGD. The first group was placed in artificial cerebrospinal fluid (ACSF) with glucose and aerated with O2. The second group, during the ischemia period (60 min), received glucose-free ACSF aerated with N2, and during reperfusion (120 min), O2 and glucose were restored. Biochemical analyses of lactate dehydrogenase (LDH) release to assesses cell viability, and glutamate release, to evaluate excitotoxicity, were performed. The results were analyzed using two-way ANOVA (p<0.05), followed by Tukey's post-hoc test. The RODs had dimensions of length x diameter (nm): 24.7 x 11.1 and a total area of 1250 nm2. The physical characteristics of ROD-CTAB, ROD, ROD + Ang-(1-7) were, respectively: LSPRT λmax (nm): 517; 519; 519; LSPRL λmax (nm): 644; 648; 645; concentration (nM): 16.6; 9.5; 0.6; the charge measured through the PZ (mV) for the ROD and ROD + Ang-(1-7) was: +7.77; +31.1, respectively.. The binding rate of Ang-(1-7) to RODs was 40%. During the ischemia period, a lower LDH release was observed in the ROD + Ang-(1-7) groups at concentrations of 1.5 nM (p = 0.0019) and 15 nM (p = 0.0085) compared to their controls, as well as, in the free Ang-(1-7) group (p = 0.0010). This reduction was also observed for glutamate release in the ROD + Ang-(1-7) groups at concentrations of 1.5 nM (p = 0.0215) and 15 nM (p = 0.0259) compared to their controls, and in the free Ang-(1-7) group (p = 0.0191). No significant differences were found in the expression of caspases 9 and 3, and biodistribution results revealed the presence of gold in the
liver. Our results indicated successful synthesis and biofunctionalization of RODs with Ang-(1-7), demonstrating neuroprotection in the in vitro ischemia-reperfusion model. In the future, it is expected that RODs with Ang-(1-7) can be used as a more effective delivery strategy for Ang-(1-7), enhancing its bioavailability in an in vivo model, when compared to free Ang-(1-7).
Assunto
Fisiologia, Farmacologia, Neuroproteção, Disponibilidade Biológica, Encéfalo, Nanotubos
Palavras-chave
Nanocarreador, Neuroproteção, Biodisponibilidade, Encéfalo