Papel do cluster MIR-17~92 no crescimento e regeneração de neuritos em cultura primária de neurônios corticais
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
Os distúrbios neurodegenerativos (DN) são um grupo de condições, incluindo doenças neurodegenerativas crônicas e lesões traumáticas agudas, que levam à neurodegeneração e déficits neurológicos permanentes. Nos DN, os axônios são afetados precocemente, perdem sua função estrutural e sofrem degeneração axonal. Além disso, neurônios maduros quando lesados não regeneram seus axônios, o que leva à danos permanentes. Portanto, é necessário buscar novas terapias para conter a degeneração axonal e promover sua regeneração, com o objetivo de restaurar a função neuronal. MicroRNAs (miRNAs) são alvos promissores para promover proteção e regeneração axonal. O cluster miR-17~92, alvo deste estudo, regula diferentes genes envolvidos em processos neurodegenerativos e regenerativos. Por esta razão, o miR-17~92 pode ser considerado uma promissora ferramenta de modulação genética para DN. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da superexpressão do cluster miR-17~92, mediada por vetores de vírus adeno-associados (AAV), no crescimento e regeneração de neuritos e axônios no sistema nervoso central (SNC) usando modelos in vitro. Os experimentos envolvendo animais foram realizados com a aprovação do comitê de ética para experimentação animal da UFMG (237/2018). Primeiro, culturas de neurônios corticais primários foram preparadas a partir de embriões de ratos Wistar de 18 dias. As culturas foram transduzidas com vetores de AAV, o vetor de controle expressando apenas o gene repórter mCherry (AAV.CTRL) e o vetor experimental que consiste no gene repórter mCherry e o cluster miR-17~92 (AAV.miR-17~92). Após diferentes momentos, análises imunocitoquímicas foram realizadas para avaliar crescimento, arborização e regeneração de neuritos e regeneração de axônios nas culturas neuronais. Observou-se que os vetores AAV.miR-17~92 e AAV.CTRL foram capazes de transduzir eficientemente neurônios corticais primários in vitro, conforme avaliado pela fluorescência de mCherry nesses neurônios sem provocar citotoxicidade diferencial entre eles. A transdução com AAV.miR-17~92 foi capaz de aumentar o crescimento e a complexidade da arborização de neuritos em comparação com o AAV.CTRL. Análises preliminares mostraram uma tendência ao aumento da regeneração de neuritos induzida pelo AAV.miR-17~92 e também uma maior regeneração axonal, porém experimentos adicionais são necessários para confirmar esses efeitos. Uma análise de bioinformática identificou 251 mRNAs alvos do cluster AAV.miR-17~92. A avaliação de ontologia gênica dos genes codificadores dos mRNAs alvos mostrou que esses genes podem estar envolvidos com crescimento e regeneração de neuritos. Em conclusão, os dados deste trabalho mostram que o cluster miR-17~92 é capaz de aumentar o crescimento de neuritos e a complexidade de sua arborização em neurônios corticais primários, sugerindo que este miRNA pode ter um efeito benéfico na regeneração no SNC. Este trabalho pode fornecer uma melhor compreensão do papel do cluster miR-17~92 na regeneração após danos no SNC, que pode ser importante para o desenvolvimento de novos tratamentos para DN.
Abstract
Neurodegenerative disorders (ND) are a group of conditions, including chronic
neurodegenerative diseases and acute traumatic injuries, that lead to
neurodegeneration and permanent neurological deficits. In ND, axons are affected
early, lose their structural function and suffer axonal degeneration. Furthermore,
mature neurons when injured do not regenerate their axons, which leads to
permanent deficits. Therefore, it is necessary to seek new therapies to contain axonal
degeneration and promote its regeneration, with the aim of restoring neuronal
function. MicroRNAs (miRNAs) are promising targets to promote axonal protection
and regeneration. The cluster miR-17~92, target of this study, regulates different
genes involved in neurodegenerative and regenerative processes. For this reason,
miR-17~92 can be considered a promising genetic modulation tool for ND. The aim
of this study was to evaluate the effect of the overexpression of the miR-17~92
cluster, mediated by adeno-associated viral (AAV) vectors, on the growth and
regeneration of neurites and axons in the central nervous system (CNS) using in vitro
models. The experiments involving animals were carried out with the approval of the
ethics committee for animal experimentation at UFMG (237/2018). First, cultures of
primary cortical neurons were prepared from 18-day-old Wistar rat embryos. Cultures
were transduced with AAV vectors, the control vector expressing only the mCherry
reporter gene (AAV.CTRL) and the experimental vector consisting of the mCherry
reporter gene and the miR-17~92 cluster (AAV.miR-17~92). After different time
points, immunocytochemical analyses were performed to evaluate neurite growth,
branching and regeneration, as well as axonal regeneration in neuronal cultures. The
AAV.miR-17~92 and AAV.CTRL vectors were able to efficiently transduce primary
cortical neurons in vitro, as assessed by mCherry fluorescence in these neurons,
without induce differential cytotoxicity. Transduction with AAV.miR-17~92 increases
neurite outgrowth and branching compared to AAV.CTRL. Preliminary analysis
showed a trend toward increased neurite regeneration induced by AAV.miR-17~92,
as well as increased axonal regeneration, but further experiments are necessary to
confirm these effects. Bioinformatic analysis identified 251 target mRNAs of the miR-
17~92 cluster. A gene ontology analysis of the genes that codified the target mRNAs
showed that those genes could be involved in neurite growth and regeneration. In
conclusion, this study showed that the miR-17~92 cluster is able to promote neurite
outgrowth and branching in primary cortical neurons, suggesting that this miRNA
could be beneficial to promote regeneration in the CNS. This work may provide a
better understanding of the role of the miR-17~92 cluster in regeneration after CNS
damage, which could be important to the development of new treatments to DN.
Assunto
Biologia Celular, Doenças Neurodegenerativas, Terapia Genética, Regeneração, MicroRNAs
Palavras-chave
Neurodegeneração, Distúrbios neurodegenerativos, Terapia gênica,, Regeneração, microRNA