Efeito do Ranelato de Estrôncio em cultura bidimensional de osteoblastos primários e imortalizados, e em cultura tridimensional, sobre scaffolds de Osso Bovino Trabeculado
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
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Katia Lucy de Melo Maltos
Cynthia Lopes Ferreira
Cynthia Lopes Ferreira
Resumo
A compreensão dos mecanismos que regulam a osteogênese, bem como da atuação de fármacos e biomateriais que favoreçam o reparo ósseo é de fundamental importância para o estabelecimento de novas terapias de reconstrução óssea, envolvendo os pilares da bioengenharia tecidual. Biomateriais constituídos de osso bovino têm revelado resultados promissores como matrizes de preenchimento ósseo. Fármacos como o ranelato de estrôncio (RE) têm demonstrado efeitos anti-osteoporóticos importantes, e vêm sendo indicado por via oral para prevenção de fraturas, principalmente em mulheres na fase pós-menopausa. Entretanto, os efeitos locais do RE e a possibilidade de sua associação com biomateriais foram pouco investigados. Neste trabalho, analisamos o efeito do RE em culturas de osteoblastos primários (OP), extraídos das calvárias de neonatos de ratos Wistar e imortalizados (OI), da linhagem MC3T3E1, em monocamada ou associados a scaffolds de osso bovino, mineralizados (OBM) e desmineralizados (OBD), no intuito de avaliar se essas associações favoreceriam o desempenho celular in vitro. Para tanto, utilizamos o RE p.a. em meio de cultura sem suplementação adicional, para verificar sua ação sem a interferência de outros reagentes. O efeito do RE sobre a viabilidade celular foi obtido por uma curva dose-efeito através do ensaio MTT nas doses de 0,025 a 1 mM de RE. Estabelecida a dose ótima de RE a 0,1mM, os efeitos da sua administração local em osteoblastos foram avaliados nas fases de 1diferenciação celular (pela atividade da fosfatase alcalina e pela expressão dos genes marcadores osteogênicos Runx2, Colágeno I, FGFR1 e Osteocalcina, por RT-PCRq); na 2deposição de matriz orgânica (por coloração Sirius Red) e 3deposição de matriz mineralizada (por coloração de Alizarina). A viabilidade de osteoblastos cultivados sobre os scaffolds de OBM e OBD também foi avaliada por ensaios de MTT. Nossos resultados mostram que o RE possui biocompatibilidade, aumenta o metabolismo dos OP e OI e que não apresenta efeito citotóxico quando administrado in loco. Além disso, parece acelerar a diferenciação celular, aumentando a atividade da fosfatase alcalina, a expressão de alguns marcadores de diferenciação osteogênica e a síntese de matriz orgânica. Na fase de mineralização o conteúdo de íons Ca2+ diminuiu nos grupos tratados com RE em relação aos grupos controle, possivelmente pela competição e maior disponibilidade de íons estrôncio na formação dos cristais de hidroxiapatita. A matriz de osso bovino desmineralizado apresentou melhores resultados como scaffold para OP e OI. Esses resultados fornecem subsídios importantes para a continuidade de estudos in vivo com administração local do RE em sítios de reparação óssea. O sucesso da associação do RE com matrizes ósseas desmineralizadas pode possibilitar sua utilização como coadjuvante nas estratégias de bioengenharia tecidual óssea e nas terapias de preenchimento ósseo, inclusive com outros biomateriais
Abstract
Understanding the mechanisms that control osteogenesis, as well as drugs and
biomaterials that promote bone repair, is of fundamental importance for the
establishment of new therapies for bone reconstruction, representing the pillars
of tissue bioengineering. Biomaterials made up of bovine bone have unveiled
promising results as arrays for bone filling. Drugs, such as Strontium Ranelate
(SR), have demonstrated significant anti-osteoporotic effects, and have been
indicated for oral administration for prevention of bone fractures, especially for
post-menopausal women. However, so far, few studies have investigated SR
local effects, and its use in association with biomaterials. In this work, we
investigated SR effects in cultures of primary osteoblasts (PO) obtained from
Wistar rats neonates cranial calottes and immortalized osteoblasts (IO) MC3T3-
E1 cell line, cultivated in monolayer, or in association with bovine bone as
scaffolds, as mineralized (MBB) and demineralized (DBB) forms, to evaluate if
these associations would promote in vitro cell performance. We chose to work
with SR (p.a.), using medium without supplementation, to verify its action
without the interference of other reagents. SR effect on cell viability (MTT) was
determined using a dose-effect curve, with dosis ranging from 0.025 to 1 mM.
After establishing 0.1 mM as the optimum dose, the effects of the SR local
administration in osteoblasts were evaluated during the following phases: 1. cell
differentiation (by measuring alkaline phosphatase activity, and by qRT-PCR,
using Runx2, Collagen I, FGFR1 and Osteocalcin as osteogenic differentiation
markers); 2. deposition of organic matrix (using picrosirius red Collagen
staining); and 3. deposition of mineralized matrix (using alizarin red staining).
Cell viability of osteoblasts cultivated onto MBB and DBB scaffolds were also
obtained using the MTT assay. Our results suggested that SR is biocompatible,
improves PO and IO metabolism, and did not present a cytotoxic effect when it
is administrated in loco. Besides, SR appeared to accelerate cell differentiation,
enhancing alkaline phosphatase activity, the expression of osteogenic
differentiation markers, and the synthesis of organic matrix. During the
mineralization phase, the Ca2+ content decreased in the group treated with SR
in relation to the control, probably associated with Strontium competition during
the hydroxyapatite formation. DBB showed to be better scaffolds for PO and IO.
Our results indicated the importance to further investigate the local
administration of SR at sites of bone repair. The success of the association of
SR and DBB signalized the possibility of using SR as co-adjuvant for bone
tissue bioengineering, and in therapies of bone filling with other biomaterials.
Assunto
Bioengenharia, Osteoblastos, Bovinos, Osso Esponjoso
Palavras-chave
Osteoblastos primários, Osteoblastos imortalizados, Ranelato de estrôncio, Osso bovino trabeculado, Bioengenharia tecidual óssea
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