Geração de proteínas recombinantes e aplicação em testes sorológicos para detecção de anticorpos anti-Chikungunya, Zika e SARS-CoV-2.
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Edel Figueiredo Barbosa Stancioli
Luiz Felipe Leomil Coelho
Patrícia Donado Vaz de Melo
Leonides Rezende Júnior
Danielle Soares de Oliveira Daian e Silva
Luiz Felipe Leomil Coelho
Patrícia Donado Vaz de Melo
Leonides Rezende Júnior
Danielle Soares de Oliveira Daian e Silva
Resumo
Os testes sorológicos, como o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e os testes rápidos disponíveis no Brasil são dependentes de tecnologia estrangeira. Uma das principais matérias-primas importadas é o antígeno, o que torna o diagnóstico mais caro, menos acessível e sujeito a oscilações de disponibilidade devido às demandas internacionais. Este estudo visa a produção de antígenos capazes de detectar a presença de anticorpos específicos contra CHIKV, ZIKV e SARS-CoV-2, utilizando ferramentas diagnósticas. Para isso, proteínas destes vírus foram analisadas in silico e expressas em diferentes sistemas de expressão (procarioto e eucarioto). A proteína ZIKV-E produzida em E.coli não foi capaz de diferenciar soros de pacientes infectados daqueles de indivíduos saudáveis, no entanto, a mesma proteína produzida em sistema baculovírus, apresentou potencial de aplicabilidade em ELISA (acurácia de 100% para um experimento preliminar, avaliado com oito amostras soropositivas e sete negativas). Para o desenvolvimento do ELISA de CHIKV foi possível comparar o desempenho da proteína E2 produzida em sistema procarioto com versão similar, produzida em células de mamífero (HEK-293T). A acurácia do ELISA IgG foi acima de 90% para ambas as versões de E2, sendo que, neste caso, o antígeno do sistema procarioto foi considerado preferencial por ser uma opção de maior rendimento e melhor custo benefício. Em contrapartida, para IgM, a acurácia da proteína E2 produzida em E.coli foi menor comparando com a mesma proteína produzida em HEK-293T (75% e 90%, respectivamente).Por fim, as proteínas do nucleocapsídeo (N) e uma porção da Spike (S1) do SARS-CoV-2 foram produzidas em E. coli. A proteína S1 apresentou menor rendimento, insolubilidade e desempenho inferior para reconhecer soros positivos para SARS-CoV-2, quando comparada à proteína N. Os padrões de soroconversão contra as proteínas N produzidas por nós e proteínas S adquiridas externamente foram avaliados em pacientes com COVID-19. Um imunoensaio com a proteína N (EIE COVID19 IgG) foi capaz de detectar anticorpos IgG contra SARS-CoV-2 com alta sensibilidade (93%) e especificidade (100%) quando comparado a um kit de referência comercial. Durante o desenvolvimento deste trabalho, um protótipo de teste rápido e dois kits de ELISA utilizando antígenos produzidos no CT-Vacinas foram desenvolvidos. A tecnologia EIE COVID19 IgG foi validada e transferida para o Instituto Bio-Manguinhos e assim como o kit para CHIKV, encontra-se em processo de registro na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Abstract
Serological tests, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and rapid tests available in Brazil are dependent on foreign technology. The main imported raw material is the antigen, which makes the diagnosis more expensive, less accessible and subject to availability fluctuation due to international demands. This study aims to generate antigens to detect the presence of specific antibodies against CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 using diagnostic tools. The nucleotide coding sequences of proteins from these viruses were analyzed in silico and expressed in different expression systems (prokaryotic and eukaryotic). The ZIKV-E protein produced in E.coli was not able to differentiate sera from infected patients and healthy individuals. However, the same protein produced in a baculovirus system showed potential for ELISA applicability (100% accuracy for a preliminary experiment, using eight positive and seven negative samples). An ELISA to detect antibodies against CHIKV allowed the comparison between the E2 protein produced in two different expression systems: E.coli (procaryotic) versus HEK-293T (eucaryotic). The IgG ELISA accuracy was higher than 90% for both versions of E2 and the antigen of the prokaryotic system was considered preferable because it had a higher yield option. In contrast, for IgM, the accuracy of the E2 protein produced in E.coli was lower when compared to the same protein produced in HEK-293T (75% and 90%, respectively). Also, SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) and a truncated Spike (S1) was produced in E.coli. The S1 protein presented lower yields, insolubility, and poorer performances to recognize SARS-CoV-2-positive sera when compared to the N protein. Seroconversion patterns against the in-house N and commercial S proteins were evaluated in COVID-19 patients. An immunoassay using N protein (EIE COVID19 IgG) was able to detect IgG antibodies against SARS-CoV-2 with high sensitivity (93%) and specificity (100%) when compared to a commercial reference kit. During the development of this work, a prototype of a rapid test and two ELISA kits using antigens produced at CT-Vacinas have been developed. The EIE COVID19 IgG technology was validated and transferred to the Bio-Manguinhos Institute and is currently under the registration process at the Brazilian Health Regulatory Agency (ANVISA)as well as the CHIKV ELISA kit.
Assunto
Microbiologia, Infecções por Arbovirus, Zika virus, Vírus Chikungunya, Proteínas recombinantes, Ensaio de imunoadsorção, Enzimática, Diagnóstico, Vírus da SARS
Palavras-chave
ELISA, Teste rápido, Diagnóstico in vitro, Proteínas recombinantes, Arboviroses, Chikungunya virus, Zika virus, SARS-CoV-2, COVID-19