Significado funcional do gene de resposta precoce ao crescimento - EGR-1 - para a biologia do Orthopoxvírus Vaccinia
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
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Resumo
Os poxvírus são vírus que apresentam genoma DNA, dupla fita, linear e que se
multiplicam exclusivamente no citoplasma de células, tanto de vertebrados, quanto de
invertebrados. O orthopoxvirus Vaccínia (VV) é o protótipo da família Poxviridae,
tendo a capacidade de codificar mais de 200 polipetídeos.
As MAPKs (proteínas quinases ativadas por mitógenos) são importantes mediadoras de
transdução de sinais e têm papel crucial na regulação de várias funções celulares como
crescimento, proliferação, diferenciação e apoptose. Graças a isto, diversos vírus, como
parte de suas estratégias multiplicativas, manipulam a ativação de diferentes MAPKs,
como por exemplo: o vírus da hepatite B, o coxsackievirus B3, o vírus Influenza, o vírus
Epstein Barr e o HIV, dentre outros.
Uma das conseqüências da ativação da via sinalizadora MAPK, em particular
Ras/Raf/MEK/ERK/Elk, por estímulos mitogênicos, é a expressão de genes
imediatamente precoces, incluindo c-fos, c-jun e o gene de resposta precoce ao
crescimento (egr-1). Andrade e colaboradores, 2004, demonstraram que esta via
sinalizadora também é estimulada pelo VV, levando a expressão de Egr-1 e sendo
necessária à sua multiplicação. Como a análise de Egr-1, realizada acima, não
contemplava todo o ciclo de multiplicação viral, decidimos fazer um estudo mais
detalhado da mesma.
Caracterizamos a expressão de Egr-1 (mensagem e proteína) em resposta à infecção
viral e verificamos que a mesma se inicia 1 hora pós-infecção e se prolonga até tempos
tardios da infecção, isto é, aproximadamente, 36 horas pós-infecção. Verificamos
também que a mesma é dependente da multiplicidade de infecção (m.o.i.), da síntese
proteica “de novo” e da expressão de genes precoces virais e resulta da estimulação
simultânea das vias sinalizadoras envolvendo MEK/ERK e serina-treonina quinases
(STK). Também geramos, selecionamos e caracterizamos clones celulares expressando,
de forma estável, dominância negativa para MEK-1 e pudemos demonstrar que
MEK/ERK é funcionalmente relevante, tanto para a expressão de Egr-1 induzida pelo
VV, quanto para a multiplicação e o fenótipo de placa de lise viral.
Para verificar o significado funcional de Egr-1 para a biologia deste orthopoxvírus,
geramos, selecionamos e caracterizamos, clones celulares expressando, de forma
estável, siRNA para Egr-1. Pudemos demonstrar que esta proteína celular, cuja
expressão é regulada pelo vírus desde os tempos precoces até tardios da infecção, e se
localiza preferencialmente no núcleo, desempenha papel crucial na economia
multiplicativa do VV.
A descrição de uma via sinalizadora, levando a expressão de proteína celular que tenha
reflexos, tanto na multiplicação, quanto no fenótipo da placa de lise viral, explicita a
necessidade da interação deste microrganismo com seu hospedeiro. O conjunto de
resultados apresentados nesta tese não tem precedentes na literatura dos poxvírus.
Abstract
Poxviruses are viruses that present a linear, double-stranded DNA genome and multiply
exclusively in the cell cytoplasm, in both, vertebrates and invertebrates. The
orthopoxvirus Vaccinia virus (VV), is the prototype of the Poxviridae family, having
capacity to encode more than 200 gene products.
MAPKs (mitogen activated protein kinases) are important mediators of signal
transduction and have a crucial role in the regulation of several cellular functions such
as growth, proliferation, differentiation and apoptosis. Due to this, several viruses, as
part of their multiplication strategy, regulate the activation of different MAPKs, e.g., the
hepatitis B virus, the coxsackievirus B3, the Influenza virus, the Epstein Barr virus and
the VV, among others.
One of the consequences of the MAPK signaling pathway activation, in particularly
Ras/Raf/MEK/ERK/Elk, by mitogenic stimuli, is the expression of immediate early
genes, including c-fos, c-jun and the early growth response gene (egr-1). Andrade et al.
(2004) demonstrated that this signaling pathway is also stimulated by VV, leading to
Egr-1 expression and being necessary for its mutiplication. Since the analysis of Egr-1
perfomed above did not contemplate all the viral multiplication cycle, we decided to do
a more detailed study of it.
We characterized Egr-1 expression (mensage and protein) in response to viral infection
and verified that it iniciates 1 hour after infection and goes on until late times of
infection, aproximately 36 hours after infection. We also verified that it is dependent of
the multiplicity of infection (m.o.i.), “de novo” protein synthesis and of early expression
of viral genes, and results of simultaneous stimulation of the signaling pathways
involving MEK/ERK and serine-threonine kinases (STK). We also generated, selected
and characterized cellular clones stably expressing, MEK-1 negative dominance and we
were able to demonstrate that MEK/ERK is functionaly relevant, not only for the egr-1
expression induced by VV, but also for viral multiplication and viral plaque fenotype.
To verify the functional significance of Egr-1 for the biology of this orthopoxvirus, we
generated, selected and characterized cellular clones stably expressing, siRNA for Egr 1. We could demonstrate that this cellular protein, whose expression is regulated by the virus since early times of infection until late ones, is localized preferentially in the
nucleus and has a crucial role in the multiplication economy of VV.
The description of one signaling pathway, leading to the expression of cellular protein
that affects multiplication and viral plaque fenotype, explicits the necessity of
interaction of this microorganism with its host. Altogether, the results presented here,
has no precedent in the literature of poxviruses.
Assunto
Microbiologia, Genes Precoces, Orthopoxvirus, Vaccinia, Quinases de Proteína Quinase Ativadas por Mitógeno
Palavras-chave
Poxvírus, Orthopoxvirus, Vaccínia