O sistema GO em Trypanosoma cruzi: caracterização dos genes TcOGG1 e TcMYH
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Primeiro orientador
Membros da banca
Débora de Oliveira Lopes
Riva de Paula Oliveira
Riva de Paula Oliveira
Resumo
O Trypanosoma cruzi é um protozoário parasita, causador da Doença de Chagas. Assim como a maioria dos organismos vivos, é susceptível ao estresse oxidativo e precisa adaptar-se a diferentes ambientes. Portanto, o reparo de DNA é essencial para sua sobrevivência e aumento da sua capacidade de infecção (Aguiar et al., 2013). Dada a importância do reparo de DNA para T. cruzi, decidimos investigar se o parasito possui homólogos das enzimas OGG1 (TcOGG1) e MutY (TcMYH). Primeiramente, foram feitos ensaios de complementação funcional heteróloga. Para OGG1, foram feitos experimentos em Escherichia coli, porém, a expressão de TcOGG1 foi tóxica tanto para células selvagens (WT - AB1157) quanto para células fpg -/- (BH20). Entretanto, a expressão de TcOGG1 não foi tóxica para Saccharomyces cerevisiae. Leveduras mutantes ogg1-/- (CD138) possuem uma alta taxa de mutação espontânea, mas quando expressam TcOGG1 esta taxa fica similar à observada para as células selvagens (WT FF18733). Por outro lado, a expressão de TcMYH não foi tóxica para E. coli e complementou bactérias MutY-, reduzindo as frequências de mutantes para níveis similares às das células WT. Em ensaios in vitro, TcMYH foi capaz de remover uma adenina pareada com 8-oxoguanina. Também foram construídas linhagens de T. cruzi que superexpressam OGG1 ou MYH. Embora em condições-padrão estas linhagens possuam crescimento similar às células controle, os superexpressores são mais sensíveis ao peróxido de hidrogênio do que o controle. Quando tratados com benzonidazol, a droga utilizada no tratamento da Doença de Chagas, os superexpressores não demonstraram mudança em seu crescimento, em relação ao controle. Além disso, T. cruzi superexpressor de TcOGG1 exibiu menores níveis de danos no DNA nuclear, mas não no kDNA (DNA do cinetoplasto (mitocôndria)). Isto pode estar relacionado à quantidade de enzima presente nestes compartimentos celulares, bem como à distribuição desigual de outras proteínas de reparo no núcleo e no kDNA. Experimentos de localização com TcOGG1 ou TcMYH em fusão com GFP mostraram que ambas as enzimas encontram-se no núcleo e na mitocôndria do parasito. Estes resultados sugerem que T. cruzi possui proteínas 8-oxoguanina DNA glicosilase e MutY DNA glicosilase funcionais, sendo que estas participam do BER nuclear e mitocondrial do parasito. Estes resultados sugerem que T. cruzi possui proteínas 8-oxoguanina DNA glicosilase e MutY DNA glicosilase funcionais, sendo que estas participam do BER nuclear e mitocondrial do parasito.
Abstract
Trypanosoma cruzi is a protozoan parasite, causative of Chagas disease. Like most living organisms, it is susceptible to oxidative stress, and needs to adapt to distinct environments. Hence, DNA repair is essential for its survival and improvement of infection (Aguiar et al., 2013). Given the importance of DNA repair to T. cruzi, we decided to study if this protozoan has homologous of the enzymes OGG1 (TcOGG1) and MYH (TcMYH). First, we performed heterologous complementation assays. For OGG1, experiments were carried out in Escherichia coli, however, expression of TcOGG1 was toxic both to wild type (WT) cell (AB1157) and to fpg -/- cells (BH20). Nevertheless, expression of TcOGG1 was not toxic to Saccharomyces cerevisiae. Yeast mutants ogg1-/- (CD138) have an increased spontaneous mutation frequency, but when they expressed TcOGG1, this frequency was similar to the one seen for the WT cell (FF18733). On the other hand, TcMYH was not toxic to E. coli and complemented the bacterial MutY- strain, reducing the mutation frequencies to a level similar to the wild types frequencies. In in vitro assays, TcMYH was able to remove an adenine that was opposite to 8-oxoguanine. We have also constructed T. cruzi lineages that overexpress OGG1 or MYH. Although in standard conditions these lineages have similar growth in comparison with control cells, the overexpressors are more sensitive to hydrogen peroxide than control. When overexpressor parasites were treated with benzonidazole, the drug used in Chagas disease treatment, they exhibited no phenotype. Also, TcOGG1-overexpressor T. cruzi exhibited lower levels of DNA damage in the nucleus, but not in the kDNA (kinetoplast (mitochondrial) DNA). This might be related to the quantity of the enzyme present in each subcellular compartment and to the unequal distribution of other repair proteins in the nucleus and kDNA. Localization experiments with TcOGG1 or TcMYH fused to GFP showed that the protozoans enzymes are both nuclear and mitochondrial.These data suggest that T. cruzi has functional 8-oxoguanine and MutY DNA glycosylases, which participate in nuclear and mitochondrial BER.
Assunto
Tripanossoma cruzi, Bioquímica, Estresse oxidativo
Palavras-chave
Bioquímica e Imunologia