Mesoscopic models for RNA salt dependence and for oncogene probe design with locked nucleic acids
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Modelos mesoscópicos para RNA com dependência salina e para projeto de sondas ontogênicas com LNA
Primeiro orientador
Membros da banca
Mariana Torquatto Quezado Magalhães
Simone Silva Alexandre
Luciana Márcia de Oliveira
Anderson de Sá Pinheiro
Simone Silva Alexandre
Luciana Márcia de Oliveira
Anderson de Sá Pinheiro
Resumo
O fenômeno de desnaturação dos ácidos nucléicos é sugerido como uma transição de primeira
ordem e foi descrito por diferentes abordagens ao longo dos anos. Uma dessas abordagens é o
modelo Peyrard-Bishop (PB), que consiste principalmente em descrever a dupla hélice através
das ligações de hidrogênio que conectam cada par de base e a interação de empilhamento intrahélice entre pares de base adjacentes. O modelo PB obteve sucesso e concordância experimental
quando aplicado à ácidos nucleicos modificados, como Inosina e TNA. A sua viabilidade computacional e capacidade de derivar parâmetros intramoleculares de temperaturas de desnaturação
provê-nos uma ferramenta robusta para reinterpretar dados experimentais publicados e obter novas percepções sobre ligações de hidrogênio e interações de empilhamento em oligonucleotídeos.
Além disso, também podemos usar esses parâmetros para prever a temperatura de desnaturação
de sequências que não foram medidas anteriormente.
Uma parametrização em falta para o modelo PB é para RNA em baixas concentrações
de sal, devido `a quantidade limitada de temperaturas de desnaturação publicadas. Embora o
modelo PB tenha sido amplamente independente das concentrações de fita em parametrizações
anteriores, requer-se que todas as temperaturas sejam fornecidas na mesma concentração de fita.
Assim, adaptamos o modelo PB para lidar com múltiplas concentrações de fita e, dessa forma,
pudemos fazer uso de um conjunto experimental de temperaturas para modelar a ligação de
hidrogênio e as interações de empilhamento em concentrações baixas e intermediárias de sódio.
Para as parametrizações, fizemos uma distinção entre pares de bases terminais e internos, e os
potenciais resultantes foram qualitativamente semelhantes aos obtidos anteriormente para DNA.
A principal diferença em relação aos parâmetros de DNA foi o potencial de Morse em baixas
concentrações de sódio para o terminal r(AU), que é mais forte do que d(AT), sugerindo maior
intensidade da ligação de hidrogênio.
Outro problema em aberto é a fonte da estabilização fornecida por pares de bases quimicamente modificados. Uma dessas modificações é o locked nucleic acid (LNA) que devido à adição
da ponte de metileno em seu açúcar, conforma-se semelhantemente à uma hélice de RNA. Essa
alteração melhora a estabilidade geral da hélice e têm sido usada em várias aplicações, como
polymerase chain reaction (PCR), small interfering RNA (siRNA) e, antisense oligonucleotides
(ASOs). No entanto, a fonte da melhoria da estabilidade ainda não é claramente compreendida.
Estudos têm sugerido uma mudança favorável na entropia, entalpia ou em ambas, da hélice
modificada, que é principalmente relacionada à um aumento nas interações de empilhamento
de pares de bases vizinhos. Entretanto, o maior desafio está em compilar conjuntos contendo
medidas suficientes de temperatura de desnaturação em condições experimentais semelhantes e
na parametrização do modelo. Felizmente, devido à popularidade do LNA conseguimos coletar
um conjunto com mais de 300 medidas de temperatura.
Derivamos um conjunto completo de parâmetros para a inserção única de LNA em sequencias
de DNA e, ao contrário das suposições anteriores, encontramos ligações de hidrogênio mais fortes
nos pares de bases modificados e suas interações de empilhamento mostraram pouca mudança.
A parametrização completa dos pares de bases do LNA permite a otimização do seu uso em
sondas de oncogene e outros tipos de aplicações. Portanto, n´os utilizamos os parâmetros para
prever todas as inserções de LNA possíveis em variantes dos oncogenes BRAF, KRAS e EGFR.
As sondas foram selecionadas a partir do conjunto de predições de temperatura, sintetizadas e
a temperatura de desnaturação medida, a precisão das temperaturas medidas comparadas com
as temperaturas preditas foi menor que 1 ◦ C.
Abstract
The melting process of nucleic acids is suggested to be a first-order transition and has been
described by different approaches over the years. One such approach is the Peyrard-Bishop (PB)
model which mainly consists of describing the helix through the hydrogen bonds connecting each
base pair and the intra-helix stacking interaction between adjacent bases. The PB model exhibited success and experimental accordance when applied to modified nucleic acids, such as
Inosine and threose nucleic acid (TNA). Its computational feasibility and capability to derive
intra-molecular parameters from melting temperatures provide us with a robust tool to reinterpret published experimental data and achieve new insights over hydrogen bonds and stacking
interactions in oligonucleotides. Moreover, the PB model parameterization also allows us to use
those derived parameters to predict the melting temperature of non-measured sequences.
One missing parameterization for the PB model is RNA at low salt concentrations, due to
the limited amount of published melting temperatures. Although the PB model was found to be
largely independent of strand concentrations, it requires that all temperatures are provided at the
same strand concentrations. We adapted the PB model to handle multiple strand concentrations
and in this way, we were able to make use of an experimental set of temperatures to model the
hydrogen bond and stacking interactions at low and intermediate sodium concentrations. For
the parameterizations, we make a distinction between terminal and internal base pairs, and the
resulting potentials were qualitatively similar as we obtained previously for DNA. The main
difference from DNA parameters, was the Morse potentials at low sodium concentrations for
terminal r(AU) which is stronger than d(AT), suggesting higher hydrogen-bond strength.
Another open problem is the source of the stabilization provided by chemically modified base
pairs. One such modification is the locked nucleic acid (LNA), which due to the methylene bridge
addition in the sugar moiety mimics the conformation of an RNA helix. This change improves
the overall stability of the helix and has been used in several applications such as in polymerase
chain reaction (PCR), small interfering RNA (siRNA), and antisense oligonucleotides (ASOs).
However, the source of the stability improvement is not clearly delineated yet. Studies have
suggested a favorable change either in the entropy, enthalpy, or both, of the modified helix,
which is mainly driven by an enhancement in the stacking interactions of neighboring base
pairs. The major challenge lies in compile sets containing sufficient measurements of melting
temperature at similar buffer conditions and in the model parameterization. Fortunately, due
to LNA popularity, we were able to collect a data set of over 300 temperature measurements.
We have derived a complete set of parameters for the LNA insertion in DNA sequences
and contrarily from the previous assumptions we have found stronger hydrogen bonding in
the modified base pairs and their stacking interactions have shown little change. A complete
parameterization of LNA base pairs allows the optimization of their use in oncogene probes
and other types of applications. Therefore, we used the parameters to predict all possible LNA
insertions in oncogene variants of BRAF, KRAS and EGFR. The probes were selected from
the pool of temperature predictions, synthesized and their melting temperature measured, the
accuracy of the measurements with the predictions was of 1 ◦C.
Assunto
Biologia computacional, DNA, RNA, Modelos teóricos, Desnaturação de ácido nucleico, Ligações de hidrogênio
Palavras-chave
Computational biology, DNA, RNA, Theoretic models, DNA melting, Hydrogen-bonds