Validação de ensaio multiplex por reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de hibridização reversa (dot blot) em espécimes do trato respiratório inferior
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Dissertação de mestrado
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Resumo
A pneumonia é uma doença inflamatória aguda dos pulmões, provocada por um distúrbio infeccioso/inflamatório do parênquima pulmonar, que atinge, especialmente, os alvéolos pulmonares. No diagnóstico de pneumonia, parâmetros clínicos e valores laboratoriais são sensíveis, mas inespecíficos para etiologia da infecção. O exame microbiológico de amostras do trato respiratório inferior é estabelecido como um método confiável. Porém, as culturas geralmente precisam de 2 a 5 dias para fornecer resultados definitivos. Buscou-se neste estudo uma otimização de protocolo para diagnóstico etiológico e de genes de resistência para futura implementação na rotina de diagnóstico laboratorial de pneumonia, através da padronização e validação metodológica de um painel molecular de genes bacteriano usando amostras respiratórias. O estudo foi realizado com 53 amostras respiratórias e os resultados moleculares foram comparados com a cultura microbiológica convencional, obedecendo as recomendações dos órgãos responsáveis para validação de métodos analíticos. Os resultados das análises técnicas demonstram reprodutibilidade e repetibilidade de 100% do método. Os resultado clínicos demonstraram uma prevalência de Streptococcus spp (17,39%), Pseudomonas aeruginosa (15,65%) e Klebsiella pneumoniae (14,78%) com 60,86% de detecções polimicrobianas. Os principais marcadores de resistência identificados foram os genes kpc (25,35%) e mecA (16,90%). A sensibilidade clínica geral foi de 100%, com especificidade de 99,84%. O tempo de resposta das culturas microbiológicas demoraram em média 92,28 horas versus uma média de 7,1 horas na identificação genotípica. Os resultados mostraram boa concordância com a cultura convencional, excelente repetibilidade, reprodutibilidade e alta precisão analítica e clínica em detectar microrganismos e marcadores de resistência em amostras de via aérea inferior relacionados à pneumonia. Esses resultados reforçam a ideia de que, no futuro, o padrão-ouro para o diagnóstico de pneumonia poderá ser a combinação do julgamento clínico, valores laboratoriais e os resultados de painéis moleculares.
Abstract
Pneumonia is an acute inflammatory disease of the lungs, caused by an infectious/inflammatory disorder of the lung parenchyma, which affects, especially the pulmonary alveoli. Clinical parameters and laboratory values are sensitive for diagnosing pneumonia but these parameters are nonspecific for bacterial infections. Microbiological examination of samples obtained from the lower respiratory tract is well established as a reliable method. However, cultures generally take 2 to 5 days to provide definitive results. This study was designed to optimize a protocol for the diagnosis of etiological and resistance genes for future implementation in routine laboratory diagnosis of pneumonia, through standardization and methodological validation of a molecular panel of bacterial genes using respiratory samples.The study was carried out with 53 respiratory samples and the molecular results were compared with the conventional microbiological culture, following the recommendations of regulatory agencies for the validation of analytical methods. The results of the technical analysis achieved 100% reproducibility and repeatability of the method. Clinical results showed the prevalence of Streptococcus spp (17.39%), Pseudomonas aeruginosa (15.65%) and Klebsiella pneumoniae (14.78%) with 60.86% of polymicrobial infections. The main resistance markers identified were the KPC (25.35%) and MecA (16.90%) genes. The overall clinical sensitivity was 100%, with a specificity of 99.84%. Time for diagnosis for microbiological cultures took an average of 92.3 hours versus an average of 7.1 hours for genotypic identification. The results showed good agreement with conventional culture, excellent repeatability, reproducibility and high analytical and clinical precision in detecting microorganisms and resistance markers in pneumonia-related lower airway samples. These results reinforce the idea that, in the future, the gold standard for the diagnosis of pneumonia may be the combination of clinical judgment, laboratory values and the results of molecular panels
Assunto
Ensino - Biologia, COVID-19, Vacinação, Fake News, Plano de aula, Pesquisa científica
Palavras-chave
Pneumonia, Identificação etiológica, Validação, Cultura convencional