Funções do cálcio nuclear e citosólico na sinalização celular
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Editor
Universidade Federal de Minas Gerais
Descrição
Tipo
Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
Membros da banca
Christopher Kushmerick
Celia Regina da Silva GArcia
Andre Ricardo Massensini
Alice Teixeira Ferreira
Celia Regina da Silva GArcia
Andre Ricardo Massensini
Alice Teixeira Ferreira
Resumo
O cálcio (Ca2+ ) citoplasmático e nucleoplasmático podem ser regulados independentemente. A relativa contribuição do Ca2+ citoplasmático e nucleoplasmático em processos biológicos tais como transcrição gênica, apoptose e proliferação celular ainda é matéria de especulação. Com a finalidade de explorar esta questão, utilizamos o aumento da expressão de parvalbumina (PV) e calretinina (CR) como ferramentas moleculares para tamponar seletivamente Ca2+ tanto no nucleoplasma quanto no citoplasma. Nossos dados mostram que tanto a PV quanto a CR foram eficazes em tamponar os sinais de Ca2+ em cada um destes compartimentos subcelulares. Para maximizar o número de células que expressam a PV, estas construções foram entregues às células SkHep1 por adenovírus (ad) permitindo assim, investigar funções celulares mediadas pelo Ca2+ nuclear e citosólico. A construção ad-PV-NES (Nuclear Exclusion Signal) foi eficaz no bloqueio da fosforilação da proteina Erk 1 e da expressão da proteína p38. Em contraste, a construção ad-PV-NLS (Nuclear Localization Signal) foi capaz de bloquear a fosforilação da ciclina dependente de cinase 1 (CDK1). Para estudar os mecanismos responsáveis pela geração de InsP3 nuclear, utilizamos construções que tamponam InsP3 seletivamente no núcleo ou no citosol, denominadas de Sponge NLS e NES, respectivamente. As células transfectadas com InsP3 Sponge NLS mostraram-se eficazes em bloquear o aumento de Ca2+ induzido pelo fator de crescimento hepático (HGF), mas não por arginina vasopressina (AVP). Em contraste, a construção InsP3 Sponge NES bloqueou o aumento de Ca2+ , induzido por AVP, mas não por HGF. Demostramos que o receptor de HGF, c-met, pode translocar para o núcleo de células SkHep1 após estimulação com HGF. Além disso, observamos que células SkHep1 possuem fosfolipase C (PLCy ) no núcleo. Em conjunto, estes resultados sugerem que através de PLCy, HGF pode gerar sinais de InsP3 e consequentemente Ca nuclear. Assim, sinais de Ca2+ no núcleo ou no citoplasma têm efeitos distintos na expressão e ativação de cinases e fatores de transcrição. Estas observações sobre o tráfego e função de c-met revelam um mecanismo pelo qual os sinais de Ca2+ podem ser compartimentalizados para obter efeitos celulares distintos.
Abstract
Nucleoplasmic and cytoplasmic calcium (Ca2+ ) can be regulated independently. The relative contribution of nucleoplasmic and cytoplasmic Ca2+ to biological processes such as gene transcription, cell growth, apoptosis and cell cycle control remain to be -binding proteins fully defined. In order to address this question, we target the Ca2+ parvalbumin (PV) or calretinin (CR), to either the nucleus or cytoplasm as a molecular tool to selectively buffer either nucleoplasmic or cytoplasmic Ca . These data showed that expression of targeted PV or CR was sufficient to buffer Ca2+ signals in these respective sub-cellular compartments. The PV constructs were delivered by adenovirus . The construct ad-PV-NES (ad) to explorer the functions of nuclear and cytosolic Ca2+ (Nuclear Exclusion Signal) blocked the phosphorylation of Erk1 and expression of p38. In contrast, the construct ad-PV-NLS (Nuclear Localization Signal) blocked the phosphorylation of cyclin dependent cinase 1 (CDK1). We also investigated the mechanisms responsible for InsP3 generation within the nucleus. In order to address this question, we employed an InsP binding protein (InsP3 Sponge) as a molecular tool to . SkHep1 cells expressing selectively buffer either nucleoplasmic or cytoplasmic InsInsP3 Sponge in the nucleus blocked the Ca2+ response induced by Hepatocyte Growth response in the cells was not affected by stimulation with factor (HGF), while the Ca2+ arginine vasopressin (AVP). In contrast, expression of InsP3 Sponge in the cytoplasm blocked the Ca2+ response induced by AVP, but the Ca2+ response induced by HGF was not affected. In addition, stimulation with HGF induced translocation of c-met to the nucleus and let to the presence of phospholipase C (PLCy) as well within the nucleus. and Ca2+ signals, In summary, these results show that HGF can generate nuclear InsP3and that this likely results from translocation of c-met and PLCy to the nucleus. Since signals in the nucleus and cytoplasm have distinct effects on expression and Ca2+ activation of cinases and transcription factors, these observations about c-met trafficking and function reveal one mechanism by which Ca2+ signals can be compartmentalized to obtain these distinct cellular effects.
Assunto
Celulas Nucleo, Cálcio, Citoplasma, Transdução de sinal celular, Sinalização do cálcio
Palavras-chave
Cálcio, Núcleo e Cálcio nuclear