Efeito neuroprotetor de Hancornia speciosa e constituintes em modelos in vitro e in vivo de toxicidade induzida por peptídeo amiloide.
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Universidade Federal de Minas Gerais
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Tese de doutorado
Título alternativo
Primeiro orientador
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Danielle da Glória de Souza
Isabela da Costa Cesar
Fernando Batista da Costa
Mauro Cunha Xavier Pinto
Isabela da Costa Cesar
Fernando Batista da Costa
Mauro Cunha Xavier Pinto
Resumo
O efeito protetor de Hancornia speciosa contra o déficit cognitivo foi previamente demonstrado em modelo murino de Doença de Alzheimer (DA). O presente trabalho teve como objetivo investigar o potencial neuroprotetor de H. speciosa e de seus constituintes em modelos experimentais in vitro e in vivo relacionados à DA. A composição química do extrato hidroacetônico de folhas de H. speciosa (HsE) foi investigada por CLUE-DAD-ESI-EM/EM, sendo identificados rutina, ácido clorogênico, bornesitol e proantocianidinas. Em seguida, HsE foi fracionado em coluna de Sephadex LH20, resultando em uma fração enriquecida em proantocianidinas (HsFr3). Procedeu-se à caracterização estrutural das proantocianidinas presentes em HsE e HsFr3 por CLUE-DAD-ESI-EM/EM, após reação de tiólise. Foram identificados quatro isômeros de procianidinas diméricas do tipo B C-glicosiladas e dois isômeros de procianidinas triméricas do tipo B C-glicosiladas. Subsequentemente, realizou-se a padronização de um método de CLUE-ESI-EM para a quantificação dos marcadores químicos identificados (rutina, ácido clorogênico, bornesitol e procianidinas), utilizando monitoramento de reações múltiplas (MRM). O método validado apresentou linearidade, precisão, exatidão e robustez adequados. A quantificação indicou teores (m/m) de 27,2 0,2% de rutina, 5,6 0,7% de ácido clorogênico, 6,3 0,2% de bornesitol e 5,8 0,1 de procianidinas em HsE, e 1,2 0,1% de bornesitol e 95,8 0,1% de procianidinas em HsFr3. O efeito potencial de HsE (10, 30 e 90 µg/mL), HsFr3 (10 e 30 µg/mL) e bornesitol (0,1, 1 e 3 µM) sobre a fatores pró-inflamatórios foi avaliado em células THP-1 estimuladas com LPS. Observou-se redução da excreção de IL-1β e TNF em todas as concentrações ensaiadas das três amostras, enquanto apenas a maior concentração de HsE reduziu a excreção de IL-6. Estes resultados demonstram a potencial atividade anti-inflamatória de HsE, HsFR e bornesitol a nível sistêmico. Em seguida, foi padronizado um modelo in vitro para investigar os efeitos de HsE e derivados em cultura de células neuronais SH-SY5Y estimuladas com peptídeo amiloide (Aβ1-42). A concentração de 10 µM de Aβ1-42 foi a mais adequada para os ensaios, promovendo 55% de morte celular. O tratamento das células SH-SY5Y com HsE (10, 30 e 100 µg/mL), HsFr3 (1, 10 e 30 µg/mL) e bornesitol (0,1, 1,0 e 3,0 µM) reverteu a citotoxicidade induzida pela Aβ1-42 em todas as concentrações avaliadas, retornando aos níveis basais. Esses achados demonstram o potencial de H. speciosa e derivados em reverter fatores danosos que podem levar à neurodegeneração. O efeito neuroprotetor do extrato de H. speciosa foi então avaliado em camundongos C57Bl/6 submetidos à cirurgia estereotáxica para injeção intra-hipocampal de 400 pmol de Aβ1-42. Os animais foram tratados por 7 dias com administração oral de HsE (10, 30 ou 100 mg/kg/dia) e, após eutanásia, os hipocampos foram removidos à fresco para quantificação de citocinas por ELISA. O tratamento promoveu redução nas concentrações de IL-1β, TNF e IL-6 em todas as doses administradas, observando-se 80% de redução na maior dose. Adicionalmente, animais submetidos à injeção supracitada de Aβ1-42 foram tratados por via oral com HsE (30 ou 100 mg/kg/dia) ou bornesitol (10 mg/kg/dia). Ao final do protocolo, os animais foram perfundidos e os hipocampos conservados com paraformaldeído a 4% e congelados para imunomarcação de micróglias. Observou-se redução da microgliose induzida pela Aβ1-42 nos animais tratados com HsE (100 mg/kg/dia) ou com bornesitol, em todas as regiões do hipocampo analisadas (CA1, CA3 e GD). Em CA1 e GD observou-se um retorno da microgliose próxima ao basal. Em conjunto, nossos resultados demonstram a potencialidade do extrato de H. speciosa, do bornesitol e das procianidinas constituintes em reduzir fatores associados ao desenvolvimento e progressão de doenças neurodegenerativas, como a DA. Esta atividade pode estar associada a efeitos sistêmicos, como redução de mediadores pró-inflamatórios e produção de ROS, assim como a efeitos centrais, como redução da neutoxicidade induzida pelo peptídeo β-amiloide, agindo sobre a inflamação a nível central.
Abstract
The protective effect of Hancornia speciosa against cognitive deficits has been previously
demonstrated in a murine model of Alzheimer's Disease (AD). The present work aimed to
investigate the neuroprotective potential of H. speciosa and its constituents in in vitro and in
vivo experimental models related to AD. The chemical composition of the hydroacetone extract
from H. speciosa leaves (HsE) was investigated by UHPLC-DAD-ESI-MS/MS, leading to the
identification of rutin, chlorogenic acid, bornesitol, and proanthocyanidins as constituents.
Subsequently, HsE was fractionated over a Sephadex LH20 column, affording the
proanthocyanidin-rich fraction HsFr3. The structural characterization of the proanthocyanidins
found in HsE and HsFr3 was carried out by UHPLC-DAD-ESI-MS/MS after thiolysis reaction.
Four isomers of C-glycosylated dimeric B-type procyanidins of the and two isomers of Cglycosylated trimeric B-type procyanidins were identified. Next, a UHPLC-ESI-MS method was
developed and validated for the quantification of the identified chemical markers (rutin,
chlorogenic acid, bornesitol, and procyanidins) using multiple reaction monitoring (MRM). The
validated method showed appropriate linearity, precision, accuracy, and robustness. The
quantification indicated contents (w/w) of 27.2 ± 0.2% rutin, 5.6 ± 0.7% chlorogenic acid, 6.3 ±
0.2% bornesitol, and 5.8 ± 0.1% procyanidins in HsE, and 1.2 ± 0.1% bornesitol and 95.8 ±
0.1% procyanidins in HsFr3.The potential effect of HsE (10, 30, and 90 µg/mL), HsFr3 (10 and
30 µg/mL), and bornesitol (1, 10, and 30 µM) on pro-inflammatory factors was evaluated in
THP-1 cells stimulated with LPS. A reduction in IL-1β and TNF secretion was observed after
treatment with the three samples, at all tested concentrations, while only the highest
concentration of HsE reduced IL-6 secretion. These results demonstrate the potential antiinflammatory activity of HsE, HsFR, and bornesitol at the systemic level. Then, an in vitro
model was standardized to investigate the effects of HsE and derivatives in SH-SY5Y neuronal
cell culture stimulated with amyloid peptide (Aβ1-42). The concentration of 10 µM Aβ1-42 was the
most suitable for the assays, promoting 55% of cell death. Treatment of SH-SY5Y cells with
HsE (10, 30, and 100 µg/mL), HsFr3 (0.1, 1, and 3 µg/mL), and bornesitol (0.1, 1.0, and 3.0
µM) reversed Aβ1-42-induced cytotoxicity at all evaluated concentrations, returning to baseline
levels. These findings demonstrate the potential of H. speciosa and its derivatives in reversing
harmful factors that can lead to neurodegeneration. The neuroprotective effect of the H.
speciosa extract was then evaluated in C57Bl/6 mice subjected to stereotaxic surgery for intrahippocampal injection of 400 pmol Aβ1-42. The animals were treated for 7 days by oral route
with HsE (10, 30, or 100 mg/kg/day) and, after euthanasia, the hippocampi were freshly
removed for cytokine quantification by ELISA. The treatment promoted a reduction in IL-1β,
TNF, and IL-6 concentrations at all administered doses, with an 80% reduction observed at
the highest dose. Additionally, the animals injected with Aβ1-42 as described above were treated
orally with HsE (30 or 100 mg/kg/day) or bornesitol (10 mg/kg/day). At the end of the protocol,
the animals were perfused and the hippocampi preserved with 4% paraformaldehyde and
frozen for microglia immunostaining. A reduction in Aβ1-42-induced microgliosis was observed
in the animals treated with HsE (100 mg/kg/day) or bornesitol in all analyzed hippocampal
regions (CA1, CA3, and DG). In CA1 and DG, microgliosis returned to near baseline levels.
Together, our results demonstrate the potential of the H. speciosa extract, bornesitol, and the
constituent procyanidins in reducing factors associated with the development and progression
of neurodegenerative diseases such as AD. This activity may be associated with systemic
effects, such as the reduction of pro-inflammatory mediators and ROS production, as well as
central effects, such as the reduction of β-amyloid peptide-induced neurotoxicity, acting on
inflammation at the central level.
Assunto
Palavras-chave
Neurodegeneração, Hancornia speciosa, Neuroprotecção, Neuroinflamação, SH-SY5Y, Procianidinas, Validação de método analítico
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