The Influence of Recombinational Processes to Induce Dormancy in Trypanosoma cruzi
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Universidade Federal de Minas Gerais
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A influência dos processos de recombinação na indução da dormência em Trypanosoma cruzi
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Resumo
O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta cerca de 8 milhões de pessoas em todo o mundo. A doença de Chagas pode ser dividida em dois estágios: um estágio agudo com alta parasitemia, seguido por um estágio crônico com baixa parasitemia. Recentemente, foi demonstrada a importância da dormência em relação à resistência a medicamentos em amastigotas de T. cruzi . Neste estudo, quantificamos a porcentagem de parasitas dormentes de diferentes DTUs de T. cruzi durante seus estágios replicativos de epimastigota e amastigota. Para este estudo, foram utilizadas células de T. cruzi CL Brener (DTU TcVI); Bug (DTU TcV); Y (DTU TcII); e Dm28c (DTU TcI). Para determinar a taxa de proliferação e a porcentagem de dormência em epimastigotas, células marcadas com fluoróforos foram coletadas a cada 24 horas para análise por citometria de fluxo, e as células que apresentaram fluorescência máxima após 144 horas de crescimento foram consideradas dormentes. Para a quantificação de amastigotas dormentes, tripomastigotas marcados com fluorescência foram utilizados para infectar células LLC-MK2. O número de amastigotas por célula LLC-MK2 infectada foi determinado, e os parasitas que apresentaram coloração fluorescente após 96 h de infecção foram considerados dormentes. Um número maior de células dormentes foi observado em linhagens híbridas quando comparado a linhagens não híbridas, tanto para as formas epimastigotas quanto para as amastigotas. Para investigar o envolvimento da recombinação homóloga na determinação da dormência em T. cruzi , tratamos células CL Brener com radiação gama, que gera lesões no DNA reparadas por esse processo. Curiosamente, a porcentagem de dormência aumentou nas células irradiadas com raios gama. Como já havíamos demonstrado que cepas híbridas de *T. cruzi* que ocorrem naturalmente apresentam maior transcrição de RAD51 — um gene chave no processo de recombinação — também medimos a porcentagem de células dormentes do clone CL Brener de * T. cruzi* com deleção de um único gene para RAD51. Nossos resultados mostraram uma redução significativa de células dormentes nesse mutante de *T. cruzi * CL Brener com deleção de RAD51, evidenciando o papel da recombinação homóloga no processo de dormência nesse parasita. Em conjunto, nossos dados sugerem a existência de uma diferença adaptativa entre cepas de *T. cruzi* na geração de células dormentes e que a recombinação homóloga pode ser importante para a dormência nesse parasita.
Abstract
The protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, a neglected tropical disease that affects around 8 million people worldwide. Chagas disease can be divided into two stages: an acute stage with high parasitemia followed by a low parasitemia chronic stage. Recently, the importance of dormancy concerning drug resistance in T. cruzi amastigotes has been shown. Here, we quantify the percentage of dormant parasites from different T. cruzi DTUs during their replicative epimastigote and amastigote stages. For this study, cells of T. cruzi CL Brener (DTU TcVI); Bug (DTU TcV); Y (DTU TcII); and Dm28c (DTU TcI) were used. In order to determine the proliferation rate and percentage of dormancy in epimastigotes, fluorescent-labeled cells were collected every 24 h for flow cytometer analysis, and cells showing maximum fluorescence after 144 h of growth were considered dormant. For the quantification of dormant amastigotes, fluorescent-labeled trypomastigotes were used for infection of LLC-MK2 cells. The number of amastigotes per infected LLC-MK2 cell was determined, and those parasites that presented fluorescent staining after 96 h of infection were considered dormant. A higher number of dormant cells was observed in hybrid strains when compared to non-hybrid strains for both epimastigote and amastigote forms. In order to investigate, the involvement of homologous recombination in the determination of dormancy in T. cruzi, we treated CL Brener cells with gamma radiation, which generates DNA lesions repaired by this process. Interestingly, the dormancy percentage was increased in gamma-irradiated cells. Since, we have previously shown that naturally-occurring hybrid T. cruzi strains present higher transcription of RAD51—a key gene in recombination process —we also measured the percentage of dormant cells from T. cruzi clone CL Brener harboring single knockout for RAD51. Our results showed a significative reduction of dormant cells in this T. cruzi CL Brener RAD51 mutant, evidencing a role of homologous recombination in the process of dormancy in this parasite. Altogether, our data suggest the existence of an adaptive difference between T. cruzi strains to generate dormant cells, and that homologous recombination may be important for dormancy in this parasite.
Assunto
Trypanosoma cruzi, Doença de Chagas
Palavras-chave
Recombination, Trypanosoma cruzi, Dormancy, DNA metabolism, Infection
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Endereço externo
https://www.frontiersin.org/journals/cellular-and-infection-microbiology/articles/10.3389/fcimb.2020.00005/full